向日葵ARF基因家族全基因組鑒定及其耐鹽抗旱功能分析

中圖分類號： 5565.501 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）14-0043-12

生長素響應因子（ARF）作為植物特有的一類轉錄因子，通過與生長素響應基因中的生長素響應元件（AuxRE）特異性結合[1-2]，參與多個植物生長發育過程，如細胞分裂、種子發育、器官形成以及果實成熟[3-6]。ARF蛋白通常具有3個保守結構域：（1）DBD（N端高度保守的B3DNA結合結構域），可直接與AuxRE特異性結合；（2）具有可變序列的MR（中間的Auxin_resp結構域），可激活或抑制靶基因表達;（3）CTD（C末端二聚化結構域），該結構域與Aux/IAA蛋白結構域Ⅲ和結構域V具有同源性，通過形成ARF-ARF和ARF-Aux/IAA二聚體，從而調控下游生長素響應基因表達[-8]。

除了參與生長素信號轉導和調節植物生長發育過程外，ARF基因在非生物脅迫響應中也發揮了重要作用。Tombuloglu通過探究大麥在不同逆境脅迫（熱、干旱、鹽和過量硼）條件下20個 HvARF 基因的表達模式，發現 HvARF 參與大麥生長發育和脅迫響應過程[9]。也有研究表明，在干旱條件下ZxARF5b?ZxARF7c?ZxARF6c 和 ZxARF7d 基因表達水平顯著上調，這可能有助于提高多槳旱生植物霸王的抗旱性[10]。研究發現，除 StARFl9a 基因外，在鹽脅迫下馬鈴薯 StARF 基因表達量均顯著上調[1]。自1997 年首次在擬南芥中鑒定出 AtARF1以來[12]ARF基因家族在越來越多的植物物種中得以鑒定，如松樹（13個）[3]、水稻（25個）[13]、胡楊（34個）[6]、大豆（51個）[14]，馬鈴薯（20個）[1]等。

向日葵（HelianthusannuusL.）是我國重要的油料作物之一，廣泛種植于干旱及半干旱地區，然而，隨著水資源短缺和土壤次生鹽漬化問題的日益加劇，嚴重降低了向日葵產量與品質[15]。鑒于ARF基因家族在干旱和鹽脅迫抗性中的關鍵作用，迫切需要對向日葵ARF基因家族進行全基因組鑒定。本研究基于已公布的向日葵全基因組序列2.0版，對向日葵ARF基因家族進行生物信息學分析，并使用轉錄組數據和RT-qPCR技術，分析在干旱和鹽脅迫下向日葵ARF基因的表達模式，以期為研究向日葵ARF基因抗旱耐鹽功能提供理論基礎。

1材料與方法

1.1向日葵ARF基因家族成員鑒定

從Ensembl Plants 網站（http：//plants.ensembl.org/index.html）查找并下載向日葵全基因組數據，首先通過TBtools將其與擬南芥ARF基因家族成員的蛋白質序列進行比對，刪除重復項，得到向日葵ARF候選蛋白序列。隨后從Pfam數據庫（http：//pfam.xfam.org）查詢ARF轉錄因子家族蛋白保守序列（PF06507），并下載ARF蛋白的隱馬爾可夫模型文件，使用hmmsearch模塊設置參數： E 值 lt;1× 10^-5 ，將保守序列與向日葵蛋白序列進行比對，刪除重復項后，得到另一組向日葵ARF候選蛋白序列。將2組候選序列合并，去除相似度 ?50% 的序列和不完整的序列后，使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）檢驗所獲取序列的保守結構域，最終獲得49個ARF基因家族成員，并對其重新命名（表2）。

1.2 系統發育樹構建

利用MEGA7.0軟件對向日葵、水稻和擬南芥的ARF蛋白序列進行多序列比對，并采用最大似然法（ML）構建系統發育樹，其中Bootstrap設置為1000，其他參數采用默認值[16]

1.3向日葵ARF基因家族基因結構、保守基序與順式元件分析

在MEME 在線網站（https：//meme-suite.org/meme/上對ARF蛋白保守基序進行分析，最大基序數設置為10，獲取結構域信息文件。通過TBtools將向日葵ARF基因結構進行數據可視化[17]。選取向日葵ARF基因上游 2000bp 序列，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測啟動子區域的順式元件，使用TBtools對分析結果進行可視化[18]

1.4向日葵ARF基因家族染色體定位和共線性分析

利用TBtools從ARF基因序列中提取密度文件，并將其與基因序列及注釋文件進行數據可視化。同時，通過TBtools從向日葵的蛋白質數據和注釋文件中獲取染色體長度信息、基因起始中止信息[4]，并分析49條向日葵ARF基因的染色體位置和種內共線性關系，及其與擬南芥ARF基因家族的種間共線性關系[19]

1.5向日葵ARF蛋白理化性質分析

通過在線網站ExPaSy（https：//web.expasy.org/compte_pi/對向日葵ARF蛋白的氨基酸數量、蛋白分子量（ku）理論等電點及親水性等理化性質進行預測[20]。利用在線工具ProtComp9.0（http：//www.softberry.com/）進行亞細胞定位預測。使用 SOPMA（https：//npsa.lyon.inserm.fr/）預測向日葵ARF蛋白二級結構。使用在線軟件SWISS - MODEL（https：//swissmodel. expasy.org/）進行ARF蛋白的三級結構預測[21]。

1.6向日葵ARF蛋白互作網絡預測

以49個向日葵ARF蛋白為研究對象，通過在線軟件 STRING（https：//cn.string-db.org/）對向日葵ARF蛋白互作網絡進行預測分析[20]

1.7向日葵ARF基因組織表達分析

基于公開的轉錄組數據，分析49個HaARF基因在向日葵舌狀花子房、舌狀花舌葉、管狀花子房、管狀花花冠、葉、根、莖、花粉、雄蕊、花柱和苞片11種組織中的表達情況[15]。利用TBtools 繪制基因表達熱圖。

1.8向日葵脅迫處理及ARF基因表達分析

試驗于太原學院智能溫室開展，選取飽滿且大小一致的向日葵種子（TD-567），將種子播種于濕沙中，待幼苗長至 3～5cm 時，移至水培箱。培養至4張真葉時進行脅迫處理，將向日葵幼苗根部分別浸入含有 15% PEG－6000（模擬干旱脅迫）和200mmol NaCl （鹽脅迫）溶液中進行處理，在干旱脅迫0（CK） ，3，6，9h 以及鹽脅迫0（CK）、6、12、24h時分別進行取樣，用液氮速凍，并保存于 -80°C 冰箱。每個處理時間點的樣品均取3次生物學重復。利用SweScript All-in-One RTSuperMix forqPCR（One-StepgDNARemover）試劑盒（G3337，武漢賽維爾生物科技有限公司）逆轉錄合成 。使用PrimerPremier5.0軟件設計引物（表1），選用向日葵ACT2作為內參基因。使用UniversalBlueSYBRGreenqPCRMasterMix進行qPCR擴增反應。反應程序設定為： 95^°C 預變性 30s;95^qC 變性15s， 60^°C 退火/延伸 30s，40 個循環。采用 法計算HaARF的相對表達量。使用SPSS12.0軟件進行方差分析， 0rigin2019 軟件繪圖。

表1RT-qPCR所用引物序列

2 結果與分析

2.1向日葵ARF蛋白理化性質及二級結構

通過分析向日葵全基因組序列，共鑒定出49個HaARF基因家族成員（表2），將其命名為HaARF1～HaARF49。蛋白理化性質分析顯示，HaARF家族成員的氨基酸數量為72（HaARF31）～1096（HaARF32）個，蛋白分子量為8.45（HaARF26）～122.73（HaARF32） ku 。39個家族成員的等電點小于7，屬于酸性，表明大部分ARF蛋白在酸性環境中發揮作用。不穩定指數介于41.80（HaARF7）～84.88（HaARF27）之間，均屬于不穩定蛋白。除HaARF7和HaARF46外，其余47個HaARF家族成員均為親水蛋白。亞細胞定位預測結果顯示，42個蛋白定位在細胞核中，其余成員分別定位在細胞質（3個）、細胞外（1個）葉綠體（2個）和線粒體（1個）。

表2向日葵ARF蛋白理化性質及二級結構

表2（續）

2.2系統發育樹構建分析

將向日葵、擬南芥和水稻的ARF蛋白構建系統發育進化樹（圖1）。結果表明，3個物種共97個ARF家族成員被劃分為4個亞家族（I、Ⅱ、I、V和V）。HaARF蛋白在4個亞家族中均有分布。此外，向日葵與擬南芥間存在2對直系同源基因（HaARF6/AtARF1、HaARF5/AtARF6），而與水稻間并未發現，這可能是由于水稻屬于單子葉植物。

2.3基因結構和保守基序分析

對向日葵HaARF家族成員保守基序進行分析發現，除HaARF2外，其余HaARF均含有Motif5基序（圖2）。Motif4基序也存在于大部分HaARF中，僅HaARF2、HaARF14HaARF18和HaARF49中不存在。同一亞族成員具有相似的結構域組成，例如，I亞家族中除HaARF2和HaARF14外，其余HaARF都含有DBD結構域、Auxin_resp結構域和CTD結構域。對向日葵HaARF基因外顯子數量進行分析，發現HaARF基因外顯子的數量差異較大，最多的含有15個，而最少僅存在2個。但同一亞族中多數基因成員外顯子數量相近。

2.4HaARF蛋白二、三級結構分析

HaARF蛋白的二級結構以無規則卷曲為主，α-螺旋和延伸鏈次之，β-折疊最少（表2）。此外，同一亞家族的HaARF蛋白三級結構較為相似，例如，HaARF4/HaARF44、HaARF3/HaARF25、HaARF46/HaARF47/HaARF48和HaARF7/HaARF13/HaARF20/HaARF32等（圖3）。

圖2向日葵HaARF家族成員系統發育樹、保守基序、保守結構域和基因結構

圖3向日葵ARF蛋白三級結構

2.5啟動子順式作用元件分析

HaARF基因的順式作用元件與激素類響應、非生物脅迫響應、光響應以及生長發育相關（圖4）。HaARF46和HaARF12基因含有的順式元件數量最多，其次是HaARF1、HaARF21和HaARF47。在激素類響應元件中，數量最多的是茉莉酸甲酯響應元件（TGACG-motif和CGTCA-motif），其次是脫落酸響應元件（ABRE）。在光響應元件中，G-box作用元件的數量最多。值得注意的是，HaARF基因中非生物脅迫響應作用元件數量較多的是厭氧誘導響應元件（GC-motif和ARE）和干旱誘導響應元件（MBS）。上述結果表明， HaARF 基因可能在激素信號轉導、非生物脅迫以及光響應等方面發揮關鍵作用。

2.6染色體定位及共線性分析

由圖5可知，49個HaARF基因不均勻分布于16條染色體上。其中，14號染色體上ARF基因數量最多，包含5個HaARF基因；12號染色體和17號染色體上均僅包含1個HaARF基因。此外，49個HaARF基因存在3對串聯重復基因，分別為HaARF21/HaARF22HaARF29/HaARF30HaARF39/HaARF40。

為進一步探究基因遺傳進化關系，對HaARF基因家族進行種內共線性及與擬南芥ARF基因家族種間的共線性分析（圖6）。結果顯示，HaARF基因家族中不僅存在3個串聯重復基因對，即HaARF21/HaARF22、HaARF29/HaARF30、HaARF39/HaARF40；還存在27個片段重復基因對，如HaARF1/HaARF13、HaARF1/HaARF23、HaARF3/HaARF35、HaARF13/HaARF23、HaARF25/HaARF41和 HaARF35/HaARF40等。此外，10個HaARF基因家族成員與雙子葉植物擬南芥ARF存在12對共線關系。

圖4向日葵HaARF基因啟動子順式作用元件分析

2.7蛋白互作網絡分析

為了預測向日葵HaARF蛋白之間的相互作用，利用STRING軟件構建了向日葵HaARF的蛋白質相互作用（PPI）網絡（圖7）。結果顯示，向日葵共有11個HaARF蛋白與10個IAA蛋白存在互作關系。

2.8向日葵ARF基因家族表達分析

分析HaARF基因在舌狀花子房、舌狀花舌葉、管狀花子房、管狀花花冠、葉、根、莖、花粉、雄蕊、花柱和苞片中的表達模式（圖8），可將HaARFs基因聚類為3組。I組包含13個HaARF基因，這些基因在所有組織中表達水平很低或幾乎沒有表達。Ⅱ組包含的18個HaARF基因中，雖然它們在花粉中低表達，但在其余組織中表達量較高。其中，HaARF11HaARF23、HaARF42、HaARF44在大部分組織中具有較高的表達水平。進一步分析串聯復制基因對或片段復制基因對的組織表達差異，結果發現超過一半（ 60% ）的基因對聚類在同一分支。例如，串聯復制基因對HaARF21/HaARF22和片段重復基因對HaARF13/HaARF23分別聚類于I組和Ⅲ組。

從本課題組前期測定的向日葵轉錄組測序結果中提取干旱和鹽脅迫下49個 HaARF 基因的表達數據可知，在干旱和鹽脅迫條件下， HaARF 表達模式不同（圖9）。例如，高表達基因HaARF17在干旱處理 ^9h 內其相對表達量呈現持續上升的趨勢；而在鹽脅迫下HaARF17基因在 12h 時表達量達到峰值后出現下降趨勢。9個HaARF基因在干旱脅迫下表達量逐漸上調，其中HaARF17、HaARF19、HaARF23上調幅度較大，4個HaARF基因在干旱脅迫下表達量持續下調。在鹽脅迫條件下，4個HaARF基因表達量持續上調，其中HaARF14和HaARF23基因表達量上調幅度較大;4個HaARF基因在鹽脅迫下表達量持續下調。

為了驗證以上轉錄組測序結果，選取表達量較高的HaARF17以及分別在干旱脅迫和鹽脅迫處理下變化明顯的HaARF19和HaARF38進行RT-qPCR分析（圖10）。結果顯示，HaARF17在干旱脅迫 ³?6h 的相對表達量與CK相比無明顯差異，而在^9h 顯著上調（ Plt;0.05） ；與CK相比， HaARFI9 相對表達量在干旱脅迫 ³h 無明顯變化，而 6h 顯著上調，并在 ^9h 時顯著下調（ Plt;0.05） 。HaARF38則隨著鹽脅迫時間的延長，相對表達量持續大幅下降。在鹽脅迫期間，HaARF17基因在 ^12h 時表達量急劇上升，雖在 24h 表達量下降但仍顯著高于CK。HaARF17在干旱脅迫和鹽脅迫達到峰值時的表達量，分別是相同脅迫下CK的2.09、2.58倍，推測HaARF17在向日葵抗旱耐鹽過程中發揮重要作用。

3討論與結論

ARF通過與生長素反應元件特異性結合，調控生長素反應基因表達，在植物生長發育過程和逆境脅迫響應中發揮關鍵作用[2]。本研究共鑒定出49個向日葵HaARF基因家族成員，相較于香榧15個[22]和馬鈴薯20個[1]， HaARF 基因數量較多，可能是在向日葵的早期進化過程中該家族成員經歷了較多的基因串聯復制或片段復制事件[23]。本研究共線性分析結果也證實， HaARF 基因存在27個片段重復基因對和3個串聯重復基因對（圖6）。理化性質分析結果顯示，49個HaARF蛋白氨基酸數量和分子量差異較大，且均為不穩定蛋白，表明HaARF蛋白具有多樣性[23]。研究者在對白樺[17]甘蔗[24]紫花苜蓿[21]、石斛[25]ARF蛋白亞細胞定位中已經發現，ARF蛋白主要在細胞核中發揮作用。本研究也發現，僅有7個HaARF蛋白定位在細胞核外，其余42個HaARF蛋白均定位在細胞核上。系統發育分析將向日葵ARF家族分為4個亞家族，而有的物種中分為3～6個亞家族，這可能與不同物種進化過程中的保守性有關[26]。進一步分析蛋白結構域有助于探究相關基因的功能[1]，研究表明，ARF通過特異性結合生長素反應元件（AuxRE）TGTCTC序列，從而與生長素信號轉導的多個途徑中生長反應基因協同作用并調節其表達[27]。本研究發現40個HaARF蛋白都含有DBD結構域（圖2），而部分HaARF蛋白沒有CTD結構域，可能導致其不能與Aux/IAA家族基因二聚化，而無法參與蛋白質間的相互作用，致使缺失某些功能[28]。本研究中，雖然HaARF家族成員的外顯子數量差異較大，含2～15個不等，但同一亞族成員具有相似的基序組成，且基因結構相近，這與先前的研究結果相似[29]此外，本研究通過蛋白三級結構分析也發現，具有相同三級結構的HaARF蛋白多為同一亞家族成員（圖3），推測屬于同一亞家族成員可能具有相似的功能，這可為預測其生物學功能提供見解[21]

A—HaARF基因家族種內共線性關系；B—HaARF基因家族與擬南芥ARF基因家族的共線性關系

圖6HaARF基因家族種內及其與擬南芥ARF基因家族種間的共線性分析

圖8向日葵HaARF基因在11種組織中的表達模式

圖9干旱和鹽脅迫下向日葵HaARF基因表達譜

基因復制是植物進化過程中基因家族成員數量增加及其功能分化的主要因素[30]。共線性分析顯示，HaARF基因家族發生了片段復制和串聯復制，表明HaARF基因家族在進化過程中具有較強的保守性，這可能對向日葵長期進化適應至關重要[31]。前期研究表明，作為生長素信號傳導中調節下游反應的關鍵因子，ARF蛋白與IAA蛋白相互作用，在植物發育中發揮信號轉導和基因表達調控的重要作用[32-33]。本研究通過蛋白質互作網絡（PPI）分析發現，向日葵ARF蛋白與10個IAA蛋白存在50條不同強度的互作關系。Tombuloglu在大麥ARF基因順式元件研究中發現ARF基因家族可能在激素信號轉導、生物/非生物脅迫以及光響應發揮作用[9]。本研究中，49個HaARF啟動子區域中均存在與激素類、非生物脅迫和光響應相關的作用元件，表明HaARF基因可能主要參與光響應、激素調節和逆境脅迫響應。前期研究表明，除CpARF24 和CpARF27外，西葫蘆29個CpARF基因均表現出對鹽脅迫的快速應答反應。其中，與對照相比， CpARFO4?CpARF23?CpARF25?CpARF26 在"³h 時顯著上調[20]。最新研究表明，青錢柳 34 個CpARF 基因中有32個對鹽脅迫具有明顯響應；干旱脅迫對24個基因表達量均有顯著影響（ Plt; 0.05）[34]。本研究中，HaARF基因在2種脅迫下呈現不同的表達模式。RT－qPCR結果進一步證實，在2種脅迫下HaARF17表達均出現了顯著上調，而HaARF38受鹽脅迫抑制明顯。可見， HaARF 可能通過復雜的作用機制調控向日葵的抗旱耐鹽潛力，后續需要進一步研究來證實這些HaARF的特定生物學功能。

圖10干旱和鹽脅迫下HaARF基因表達情況

A—CK、D3、D6、D9分別為干旱脅迫條件下0、3、6、9h時HaARF基因相對表達量；B—CK、S6、S12、S24分別為鹽脅迫處理的0、6、12、 24h 時HaARF基因相對表達量。不同小寫字母表示處理之間存在顯著差異 （Plt;0.05）

總之，本研究共鑒定出49個HaARF基因，不均勻分布于16條染色體上，可分為4個亞家族。向日葵HaARF含有大量與激素、非生物脅迫和光響應相關的順式作用元件。在干旱和鹽脅迫條件下，HaARF基因呈現誘導性表達，推測其可能在向日葵抗旱耐鹽功能中發揮重要作用。上述結果可為深入研究HaARF抗旱耐鹽功能及其調控機制提供理論基礎。

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