耐鹽芽孢桿菌B3的篩選、產芽孢條件優化及耐鹽促生效果

中圖分類號：S182 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）14-0224-09

土壤鹽漬化是制約農作物生產的主要非生物因素之一[1-3]。全球受鹽漬化影響的土地面積超過83.3億 hm² ，占總耕地面積的 20% 以上，預計到2050 年，將有1/2的耕地受到鹽漬化的影響[4-5]。Hassani等指出，在1980—2018年期間，亞洲、非洲和澳大利亞是受土壤鹽漬化影響最大的大陸，其中我國以2.11億 hm² 的鹽漬土面積位居世界首位[6。然而，由于人口持續增長、灌溉方法不當以及全球氣候變化等因素，土壤鹽漬化的速度遠超人類預期，這將對我國糧食生產造成限制，嚴重阻礙農業的可持續發展。

鹽堿地中主要的化合物是NaCl，大部分農作物對鹽分敏感，無法在高水平的土壤鹽度中生長，因而生長受到抑制[7-8]。在鹽脅迫下，高鹽水平會破壞植物細胞內的滲透平衡，導致水分吸收和膨壓降低，由此產生的脫水脅迫會降低氣孔導度和光合酶功能[9-10]。此外，鹽度脅迫可誘導植物產生活性氧（ROS），對細胞結構造成氧化損傷[1]。過量的 Na⁺ （20和 K⁺ 對植物有毒，它們在植物組織中的積累，破壞重要的代謝過程[12]。因此，土壤中高濃度的鹽會對植物生長的各個階段產生有害影響，最終阻礙植物的生長和生產。

植物促生菌（plant growthpromotingbacteria，PGPB）是一類與植物相關的多種微生物，它們通過直接或間接與植物相互作用，促進植物生長發育[13-14]。越來越多的研究表明，PGPB 可改善鹽脅迫中植物的種子萌發、生長發育、產量和果實品質等[15-16]。在鹽濃度為 5. 84g/L 時，耐鹽菌PseudomonasbrassicacearumYZX4能顯著提高白菜種子的萌發率、幼苗根、莖長和平均鮮重[17]。與對照相比，解淀粉芽孢桿菌MCZ-2顯著促進植物生長，提高可溶性糖、類胡蘿卜素含量，增強超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）的活性，并降低丙二醛（MDA）的含量[18]。在鹽脅迫下，接種耐鹽促生菌W-1可顯著提高紅豆草的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸（Pro）、葉綠素含量以及CAT活性，并降低過氧化氫含量，減緩鹽脅迫對紅豆草生長的不利影響[19]。因此，植物生長促生菌可有效緩解鹽脅迫對農作物生長的抑制作用，這為保障糧食安全生產提供了可行策略。

谷子（SetariaitalicaL.）屬于禾本科，是一年生草本植物，主要在我國黃河中上游地區種植。由于富含蛋白質、碳水化合物、脂肪、礦物質、維生素和生物活性化合物等多種有益健康的成分，谷子有望成為極具前景的功能性食品[20-22]。然而，鹽脅迫對谷子的產量和質量具有較大影響，我國在緩解土壤鹽漬化對谷子生產的負面影響方面，面臨著機遇與挑戰。本研究從咸菜中分離出Bacillussp.B3株，并對其產芽孢條件進行優化，以期建立有效的發酵工藝，從而降低發酵成本；同時，研究分析B3株在促進谷子生長和緩解鹽脅迫方面的能力。

1材料與方法

1.1 耐鹽芽孢桿菌的分離與篩選

樣品采自山西省長治市潞州區菜市場（36^°12^′51^′′N，113^°8^′41^′′E） 購買的3種咸菜。分別取 1.0mL 咸菜汁與 9.0mL 無菌水均勻混合，將混合液在 80^°C 熱水中熱處理 15min ，待其冷卻至室溫后，以含 5% NaCl的LB培養基為選擇培養基，采用稀釋平板法分離、純化菌株[23]。將初步篩得到的菌株在含不同濃度（ 5% （20 9% 、 12% 、 13% 和 14% ，質量體積比）NaCl的LB培養基中培養 24h ，測定菌株對不同鹽濃度的耐受性。所有試驗均在長治學院北校區（山西省長治市保寧門東街73號）進行，試驗時間為2023年3月至2024年11月。

1.2耐鹽芽孢桿菌的生長特性

觀察菌株B3在LB培養基上的菌落形態，并進行革蘭氏染色。在LB液體培養基上，測定該菌株對不同溫度 （20.25，30，35，40，45，50，55%） 和不同ΔpH 值 （4.0～12.0 ，梯度間隔為1.0個單位）的耐受能力。測定在 30^°C 下培養 24h 后的 D_600nm 。

1.3 16SrDNA基因分析

將菌株B3在 30^qC 的LB培養基中培養 ^16h ，用細菌基因組DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司]提取其DNA。選用引物27F和1492R對16SrDNA進行PCR擴增。反應條件：95C5min;94C45s，56C30s，72C90s，30 個循環； 72^°C 延伸 10min 。擴增產物送至北京擎科生物技術有限公司進行測序。在LPSN（https：//www.

bacterio.net/）中對獲得的 基因序列進行序列比對[24]。利用MEGA6.0軟件選用NJ法構建系統發育樹，采用bootstrap分析（1000個重復）進行置信度檢驗。

1.4 孢子計數方法

采用平板計數法對芽孢桿菌產芽孢數量進行測定。將細菌懸浮液倍比稀釋至 10^-6～10^-9 ，并將稀釋液置于 80^qC 下水浴熱處理 15min ，冷卻至室溫后，取 100μL 稀釋液均勻地涂在LB固體培養基上，在 30^°C 下培養 ^16h 后，進行菌落數計數，最終以 CFU/mL 表示芽孢數量。

1.5單因素試驗

采用單因素輪換法進行單因素試驗。在LB培養基的基礎上，依次在不同碳源（ 30.0g/L 葡萄糖、30.0g/L 蔗糖 .30.0g/L 玉米粉 .30.0g/L 可溶性淀粉 .30.0g/L 麥芽糖）及玉米粉濃度（5.0、15.0、25.0，35.0，45.0g/L? 、不同氮源（ 10.0g/L 酵母、10.0g/L 豆餅、 .10.0g/L 蛋白脈 ，3.0g/L NH₄Cl 、3.0g/L （20 NH₄NO₃ ）及豆餅濃度 （8.0，10.0，12.0， 14.0，16.0g/L ）、無機鹽 （0.5g/LNaCl，0.5g/L CaCl₂?0.5g/LMgSO₄?0.5g/LFeSO₄?0.5g/L MnCl₂ ）及 CaCl₂ 濃度 （0，0.8，1.6，2.4g/L） 處理下測定菌株B3的芽孢數量。進一步選用優化后的培養基組分，分別測定不同裝液量（ （20mL/250mL 40mL/250mL 60mL/250mL 80mL/250mL 和100mL/250mL ）、不同 pH 值 （6.0，7.0，8.0 和9.0）和不同溫度 （30，35，40，45，50‰ 處理下菌株B3的芽孢數量。

1.6 響應面法

由表1可知，在單因素試驗的基礎上選擇3個因素 CaCl₂ 濃度（A） ??pH 值（B）和溫度（C）及3個水平進行試驗處理，將芽孢數量作為響應變量。

表1試驗設計因素及水平

通過DesignExpert13.0軟件計算回歸方程。采用多元二次回歸方程根據試驗結果推導回歸系數，綜合評價響應模型性能，預測最優產芽孢條件，并在此條件下進行試驗，驗證理論結果。

1.7接種對鹽脅迫下谷子生長及生理特性的影響

菌劑制備：將菌株B3在通過響應面優化后的條件下進行培養，將菌液在 4000r/min 條件下離心10min ，棄上清，加入蒸餾水重懸菌體，將其稀釋10倍后，在 80^°C 下水浴熱處理 15min 。

谷子生長與處理：以谷子（張雜谷10號）為試驗材料，選擇顆粒飽滿、大小一致的種子，將種子播種在裝有營養土（泥炭土：蛭石：珍珠巖 =3：1：1 的花盆中。待出苗生長7d后進行鹽處理。用蒸餾水配制175mmol/LNaCl溶液，通過灌溉對幼苗進行鹽脅迫，之后將其隨機分為2組，一組加入 100mL 蒸餾水，另一組加入 100mL 菌株B3的菌懸液。幼苗每7d處理1次，連續處理28d后，隨機選擇植株測定其株高、莖粗、總鮮重、地上部鮮重、根鮮重、總干重、地上部干重、根干重。采用根系掃描儀（WinRHIZO，加拿大）對植物根系進行掃描，測定根系指標。選取谷子葉片保存在 -80°C 條件下，用于生理生化分析，包括Pro、可溶性糖、超氧陰離子、MDA的含量以及CAT、植物脫氫酶（PDHA）、SOD的活性，測定方法參照檢測試劑盒（北京盒子生工科技有限公司）。所有單位均以 U/g 表示。

1.8 數據處理

所有試驗均重復3次，通過SPSS軟件（v29.1）對測定數據進行分析并用Excel2019繪圖。顯著性水平設定為 α=0.05 。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選

以NaCl濃度為 5% 的LB培養基為篩選培養基，不斷提高培養基中NaCl濃度。由表2可知，分離出的7個菌株的耐鹽能力均能達到 5% 及以上水平，其中菌株B2、B3均能在含 12% NaCl的培養基中生長，而菌株B3的耐鹽能力最強，能在 13% NaCl的培養基中生長。因此，將B3作為耐鹽菌進行進一步研究。

2.2 菌株的鑒定

菌株B3在LB固體培養基上的菌落呈圓形，灰白色，容易挑取且有褶皺。菌株B3為革蘭氏陽性，細胞形態為桿狀。最適生長溫度為 20～55^°C ，最適生長 pH 值為 6.0～10.0 。

在NCBI數據庫中對菌株B3的16SrDNA基因序列進行比對，結果發現，該菌株與Bacillustequilensis 10b^T 的序列相似度最高 （99.86% ），其次是Bacillus subtilis IAM 12118^T（99.72%） 和Bacilluscabrialesii TE3^T（99.72%） 。基于系統進化樹（圖1）進行分析，菌株B3與Bacillustequilensis 10b^T 親緣關系最近，屬于芽孢桿菌屬，因此將其命名為Bacillussp.strainB3。

表2菌株在不同NaCI濃度下的生長情況

注： + 代表有菌落出現， ⁺⁺ 代表有較多菌落， ⁺⁺⁺ 代表有大量菌落生長，-代表無菌落生長。

2.3 單因素測定

培養基的成分和培養條件對芽孢桿菌孢子產量起著至關重要的作用。因此，在培養基中添加不同碳源、氮源和無機鹽，探究其對菌株B3孢子產量的影響。由圖2－A可知，不同碳源對菌株B3的孢子數量有顯著影響，其中以玉米粉作為唯一碳源時，芽孢數最高，其次是蔗糖，而葡萄糖最低。當添加 35.0g/L 玉米粉時，菌株B3的芽孢數達到最大值，為 206.0×10⁸ CFU/mL（圖2-B）。以豆餅作為唯一氮源時，菌株B3的芽孢數顯著高于其他氮源（圖2－C）。進一步研究發現，當豆餅濃度為12.0g/L 時，菌株B3的芽孢數達到最大值，為258.3×10⁹CFU/mL （圖2-D）。此外，不同的無機鹽對芽孢產量也有顯著影響（圖2-E），在培養基中添加 NaCl，CaCl₂ 和 MgSO₄ ，菌株B3的芽孢數顯著高于 FeSO₄ 和 MnCl₂ ，其中 CaCl₂ 對孢子產量的促進效果最為顯著。在 CaCl₂ 濃度為 0.8g/L 時，菌株B3的芽孢數達到最大值，為 251.3×10⁹ CFU/mL（圖2-F）。

在優化培養基的基礎上，測定菌株B3在不同裝液量 ??pH 值和溫度條件下的芽孢數量。當裝液量為 時，菌株B3的芽孢數量達到254.7×10⁹ CFU/mL（圖2-G）。由圖2-H可知，隨著 pH 值的增加，芽孢數逐漸增加，在 ΔpH 值為8.0時達到最大值，為 256.0×10⁹ CFU/mL。可以看出，當 pH 值從6.0增加到8.0時，孢子產量顯著提高，表明pH值的變化對菌株B3的芽孢數量具有顯著的影響。圖2-I顯示，隨著溫度的升高，芽孢數量呈先升高后降低的顯著變化趨勢，在 40^°C 時，芽孢數量達到最大值，為 229.6×10⁹ CFU/mL

圖1菌株B316SrDNA基因序列的系統進化樹

2.4響應面法優化產芽孢條件

根據單因素試驗結果，對 CaCl₂…pH 值和溫度這3個顯著影響因素進行3因素3水平的響應面試驗。基于Box-Behnken的中心組合設計原理，采用DesignExpert13.0進行試驗設計，結果見表3。

菌株B3的孢子數與各因素的二次回歸模型表示為 y=217.20+0.37A-1.88B+8.00C-26.00AB+ （ 回歸模型方差分析結果見表4，可以看出，回歸方程的 P 值為0.0004，小于0.001，表明該模型對結果影響顯著。失擬項對結果影響不顯著（ Pgt;0.05） ，表明該模型能對菌株B3芽孢數進行較好的分析和預測。同時，通過決定系數驗證了模型的置信水平0 R²=0.9608 ），表明模型是優良的。

在其他任意因素不變的情況下，檢測2種不同因素相互作用對菌株B3芽孢數的影響，并根據模型繪制響應面圖（圖3），分析得到各單因素最佳變量： CaCl₂ 為 0.81g/L， 初始 pH 值為7.99和溫度為40.41^9C ，該條件下預測得到最大響應值，即芽孢數為 217.5×10⁹CFU/mL 0

表3Box-Behnken試驗設計和結果

表4響應面模型方差分析

注： * 表示對結果影響顯著（ Plt;0.05 ； ** 表示對結果影響極顯著 （Plt;0.01） 。

在最佳產芽孢條件下進行3次平行試驗，得出產芽孢數為 210.67×10⁹ CFU/mL，與預測的最佳芽孢數相近，進一步說明該模型能夠很好地預測產芽孢的實際情況，預測結果準確可靠。

2.5接種菌株B3對NaCl處理下谷子幼苗的促生長作用

將菌株B3接種在NaCI處理下的谷子上，測定其對谷子生長的影響。由圖4可知，接種菌株B3的幼苗生長指數顯著高于對照組，谷子株高、基部莖粗、全株鮮重、全株干重、地上部鮮重和地上部干重均顯著高于對照組，分別較對照提高 88. 0% 、33.94% 、204. 44% 、307. 55% 、294. 12% 和 300% （圖4-B至圖4-G）。表明菌株B3能夠顯著促進鹽脅迫下谷子幼苗的生長。

圖3影響菌株B3芽孢數的相應等高線圖和曲面圖

圖4接種菌株B3對NaCI處理下谷子幼苗生長的影響

進一步采用根系掃描儀對谷子的根系性狀進行測定，由圖5可知，菌株B3處理的谷子幼苗根系性狀除根莖外均顯著高于對照組，表明菌株B3能夠顯著促進谷子的根系生長。與對照相比，菌株B3處理的谷子根鮮重和根干重分別增加 200% 和433.33% （圖5-B、圖5-C），由圖5-D至圖5-H可知，根長增加 317.49% ，根尖數增加 352.56% ，根表面積增加 372.85% ，根體積增加 446.67% 。

圖5接種菌株B3對NaCI處理下谷子幼苗根系生長的影響

2.6菌株B3對NaCl處理下谷子幼苗生理特性的影響

植物通過積累相容性的溶質（如可溶性糖和Pro）來滲透調節細胞，以保護自己免受鹽脅迫。與CK相比，接種菌株B3顯著提高了NaCl處理下谷子葉片中可溶性糖、Pro含量（圖6-A、圖6-B）。而在鹽脅迫下施用B3菌液后，谷子葉片中超氧陰離子含量和MDA含量顯著降低，分別降低 55.0% 和 72.1% （圖6-C、圖6-D）。

提高植物抗氧化酶活性是提高植物抗脅迫能力的有效途徑。SOD和CAT是評價植物抗逆性的重要酶指標，它們與其他酶共同構成抗氧化防御系統。鑒于菌株B3促進鹽脅迫下谷子生長的突出表現，對NaCl處理下谷子幼苗葉片中相關酶的活性進行測定。由圖6-E至圖6-G可知，與對照組相比，在鹽脅迫下經過菌株B3處理后，CAT、PDHA、SOD活性分別提高 33.0%.43.7%.37.6% ，表明菌株B3可以提高鹽脅迫下谷子的CAT、PDHA和SOD活性。

3討論與結論

鹽漬化土壤會抑制農作物生長、降低糧食產量[25]。利用植物促生菌（plant growth promotingbacteria，PGPB）來緩解鹽對農作物的脅迫是農業可持續發展的有效途徑之—[26-28]。食品級芽孢桿菌被認為是開發農業生物防治劑和工業酶的重要資源[29]，基于芽孢桿菌在鹽漬化土壤中生長的先天能力，對該菌的篩選和鑒定是改善農業生產中土壤鹽堿化問題的關鍵[30]。韋廷舟等篩選的芽孢桿菌ST37在鹽脅迫下可以促進油菜種子萌發和幼苗生長[31]。本研究從咸菜中分離到1株芽孢桿菌 B3，該菌株對NaCI的最高耐受濃度為 13% （質量體積比），對 pH 值和溫度的耐受范圍較廣，該結果為開發微生物菌肥提供菌株資源。

芽孢桿菌可生成芽孢，具有耐酸、耐鹽、耐高溫、繁殖快等特性，在微生物菌肥的應用上具有顯著優點和應用潛力[32]。芽孢數量對微生物菌肥中的有效活菌數和有效保存期至關重要，因此對菌株B3的產芽孢條件進行優化十分必要。響應面法是一種高效科學的優化方法，在微生物培養基和培養條件優化等方面被廣泛使用。Sun等采用響應面優化PichiapastorisGS115的產木聚糖酶條件，優化后產量提高2.1倍[33]。 Xu 等采用響應面方法優化B.coagulansX26的產芽孢條件，優化后X26的孢子率達到 97.93% [34]。李敏等采用響應面方法對卡氏芽孢桿菌ST-1培養基進行優化，使芽孢產量達到 5.96×10⁹CFU/mL^[35] 。本研究在單因素試驗的基礎上，選取 CaCl₂ 濃度、 pH 值和溫度為主要因素進行響應曲面優化，優化后菌株B3的產芽孢數達到 210.67×10⁹CFU/mL 。這些優化條件為菌株B3在微生物菌肥中的推廣應用奠定了基礎。

研究表明，從環境中分離出的芽孢桿菌，如B.pumilus strain JPVS11、Bacillus spp.NMTD17、B.safensisGBSW22、B.pumilusNMSW10和B.velezensisGBSW11等，定植在植物根際可以增加鹽脅迫下水稻、菜豆的株高、根長、生物量和葉綠素含量等，協助作物在鹽脅迫環境下生存[36-38]。在鹽脅迫過程中，植物可以通過自身滲透調節來調整可溶性糖和Pro 的含量，從而保護自身免受鹽分損害[39-40]。細胞膜的破壞主要是由膜質過氧化造成的，MDA含量是反映膜質過氧化最重要的指標，在鹽脅迫下茄子中 MDA 過度積累[41]。本研究發現，菌株 B3可提高谷子中可溶性糖和蛋白質的含量，降低MDA含量，這可能有助于提高谷子細胞膜的穩定性。植物體內抗氧化酶的活性反映了氧化損傷的程度，抗氧化酶可通過清除體內的ROS來減輕損傷。鹽脅迫會導致植物組織中ROS過度積累，植物中抗氧化酶的活性降低，從而導致植物細胞膜被氧化損傷[42]。在本研究中，菌株B3可降低鹽脅迫下谷子葉片中的超氧陰離子含量，而CAT、SOD和PDHA的活性均顯著提高，表明CAT、SOD和PDHA活性的提高有助于清除ROS，減輕鹽脅迫對谷子生長造成的毒性。

圖6菌株B3對鹽脅迫下谷子幼苗生理生化指標的影響

由此可知，在鹽脅迫下，菌株B3增強谷子抗氧化酶活性，以維持植株內ROS平衡，同時增加可溶性糖、蛋白質和Pro的含量，降低MDA含量，以維持細胞內滲透勢平衡。因此，菌株B3不僅可以促進谷子的生長，還能增強谷子對鹽脅迫的耐受性，表明其有望成為耐鹽促生菌的潛力。

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