鹽脅迫下谷子葉片轉錄組denovo 測序及分析

中圖分類號：S188;S515.01 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）14-0055-07

鹽害會引發植物的滲透壓力，進而觸發離子中毒現象，這會對種子的發芽、正常生長、光合作用等方面帶來負面影響，同時也會引起二次損傷，從而破壞生物體的物質代謝平衡和活性氧的累積，嚴重影響作物的品質和產量[1-3]。谷子（Setaria italica）是起源于我國的古老農作物，它在我國北部地區長期以來一直是主栽作物，被稱為中華民族的哺育作物；其特性包括抗旱能力強、適應性廣泛、存儲性能好、富含營養且既能食用又可用作飼料等優點[4]，除了在干旱和半干旱地區的農業發展上占據關鍵地位外，還在國家經濟發展方面發揮著舉足輕重的作用。鑒于此，以谷子為材料鑒定耐鹽基因及其功能，研究基因作用機制，對于提高作物的遺傳改良能力和培養更具耐鹽性的新品種至關重要。

為了有效地應對鹽脅迫，植物在演變的過程中形成了一些能夠感應滲透壓變化和離子毒性反應的機制。如HKT（high-affinity K⁺ transporter）型鉀離子通道、NSCC（non-selectivecationchannel）型非選擇性陽離子通道等[5以及細胞內的第二類信息分子 Ca²⁺ 在植物應對鹽分挑戰時有著顯著的影響。此外，還有一部分鈣結合蛋白質、激酶和轉錄因子等，它們都涉及刺激響應和信息的傳遞[6]。已知谷子對鹽堿有一定的耐受性，當環境中的鹽堿含量低于 0.3% 時，谷子可以正常生長[7]。近年來，由于完成了對谷子基因組的測序工作，使得它成為了探索禾本科植物新穎模型作物的理想選擇。從遺傳學角度來看，已鑒定出不同的基因家族及其相關蛋白質或非編碼 RNA^[8-12] 。目前，雖然在谷子耐鹽研究方面取得一些進展，但關于谷子耐鹽分子調控機制的研究相對較少，關于耐鹽分子響應機制方面的研究有待加強，須進一步挖掘谷子耐鹽關鍵基因。本研究以宛谷098為試驗材料，對鹽脅迫前后谷子苗期倒2葉葉片進行轉錄組denovo測序，獲得與耐鹽相關的差異表達基因，以期挖掘出與耐鹽相關的基因，為解析谷子分子耐鹽機制和指導谷子耐鹽育種提供理論支撐。

1材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用谷子品種宛谷098，由選育，2022年通過農業農村部登記，登記編號為GPD 谷子（2022）410136。

1.2 試驗方法

試驗在科技樓院內進行，2023年7月12日開始，選取健壯飽滿的種子，經 0.4% 高錳酸鉀消毒 1.5h ，然后用蒸餾水沖洗干凈。以營養土作為培養基質，將50粒谷子種子點播于塑料盆中，置于室外自然生長，出苗后及時間苗、定苗，每盆留均勻一致的幼苗7～8株，設2個處理：（1）處理B，谷子幼苗生長 25d 后用濃度為 150mmol/LNaCl 溶液 550mL 每2d灌溉1次， 10d 后有明顯癥狀時取樣（此時谷子植株生長緩慢、葉片邊緣出現半卷狀態，圖1）；（2）對照A，在處理B時用等量的水處理A，以避免水分脅迫十擾。以上每個處理重復3次，將樣品（倒2葉葉片）于液氮中速凍，儲存于 -80°C 冰箱中，用于轉錄組測序試驗。

1.3轉錄組測序及數據篩選處理

轉錄組denovo測序是指在不需要物種基因組序列信息的情況下，用新一代高通量測序技術對某一物種特定組織或器官在某一狀態下的轉錄本進行測序、組裝得到轉錄本序列信息。試驗部分流程主要包括樣品的質量檢測、雙鏈cDNA的合成、轉錄組文庫的構建與質檢、樣本的上機測序。轉錄組測序由開泰明鏡基因科技（北京）有限公司完成。

用二代高通量測序儀器測序得到的原始圖像數據經basecalling轉化為序列數據，結果以FASTQ文件格式存儲，包含reads的序列以及堿基的測序質量；使用R包DESeq21.28.1進行差異表達的基因分析；功能富集使用clusterProfilerv3.16.1，多重檢驗校正方法為Benjamini-Hochberg（BH）法，原始p 值的篩選閾值為0.05，校正后的 q 值（即錯誤發現率FDR的估計值）的篩選閾值為0.05。

1.4實時熒光定量RT-PCR進行功能基因驗證

從數據庫中抽取了5個上調的基因，使用Primer6.0對它們進行引物的定制（表1），并通過實時熒光定量RT-PCR來確認轉錄組測序的結果是否精確。

2 結果與分析

2.1 整體RNA-Seq 結果和質量控制

6個轉錄組文庫從Illumina測序中獲得了總共299651925個rawreads。數據過濾后，共有291251908個cleanreads。cleanreads的平均質量分數Q20和Q30分別為 97.20% 和 92.45% ，表明獲得的cleanreads質量較高。

2.2鹽脅迫處理谷子苗期葉片的轉錄組分析

RNA-Seq是一種快速、有效鑒定差異表達基因的方法。本研究利用denovo測序對宛谷098苗期葉片進行轉錄組測序。將鹽脅迫處理前后樣品分別命名為A和B，結果（圖2-A）顯示，共檢測到1793個差異表達基因（DEG），其中上調基因1054個，下調基因739個；火山圖（圖2-B）揭示上調、下調和未發生顯著變化的基因數量。

表1RT-qPCR引物序列

圖2差異基因及火山圖展示

2.3差異表達基因（DEG）功能分析

為進一步探索谷子苗期對鹽脅迫的調控機制，設定 α=0.05 差異倍數 ?2 作為標準篩選DEG，共鑒定到578個（436個上調基因和142個下調基因）DEG，其中， Plt;0.05 、差異倍數 ?8 的DEG（表2）共83個（全部為上調基因）。鑒定到的578個DEG，例如：TRINITY -DN1940_-c0_-g2_-i1 上調倍數為11.86、TRINITY -^DN6890-^c0-^g1-ⁱ³ 上調倍數為10.21、TRINITY_DN5478_cO_g1_i1上調倍數為9.98、TRINITY -^DN3037-^c0-^g1-ⁱ¹ 上調倍數為9.74、TRINITY_ 上調倍數為9.61、TRINITY_DN3071_cO_g2_i1上調倍數為9.57等。根據基因注釋，這578個DEG主要為漆酶、管蛋白∝ 鏈、熱休克 70ku 蛋白同源物4、40S核糖體蛋白SA、肌動蛋白、60S核糖體蛋白 L27a （片段）等。

表2部分谷子苗期響應鹽脅迫DEG

2.4差異表達基因（DEG）功能富集分析

對鑒定到的578個DEG進行GO和KEGG代謝途徑富集分析。

根據GO注釋分析發現，參與生物過程的基因差異表達最多，其次是細胞組分，而參與分子功能的基因較少（圖3－A）。富集顯著的前20個基因涉及13個生物過程GO項（GO：0002181、GO：0006614、GO：0006613、GO：0045047、GO：0072599、GO：0070972、GO：0000184、GO：0006612、GO：0006413、GO：0090150、GO：0000956、GO：0006402和GO：0006401）、6個細胞組分GO 項（GO：0022626、GO：0044391、GO：0022625、GO0015934、GO：0022627和G0：0015935）和1個分子功能GO項（GO：0003735）。差異基因數量最高的5個GO項是細胞質翻譯和依賴SRP的共翻譯蛋白靶向膜2個生物過程，細胞質核糖體和核糖體亞基2個細胞組分，核糖體的結構成分1個分子功能（圖3-B）。

KEGG代謝途徑富集分析結果表明，經過鹽脅迫后，有55條KEGG通路顯著富集。DEG主要富集在苯丙氨酸代謝（ ko00360 ）、細胞色素P450對異種生物的代謝（ko00980）、藥物代謝－細胞色素P450（ ko00982? 、氨基酸和核苷酸糖代謝（ ko00520） ）谷胱甘肽代謝（ ko00480 ）等代謝途徑和苯丙氨酸的生物合成（ ko00940_?"）、類黃酮的生物合成（ ko00941 ）類胡蘿卜素的生物合成（""等生物合成上（圖4）。其中KEGG的幾個主要通路中，細胞色素P450對異種生物的代謝通路有13個谷胱甘肽轉移酶基因位點和3個未注釋的蛋白質基因位點參與；苯丙氨酸的生物合成通路有8個過氧化物酶、3個苯丙氨酸解氨酶等16個基因位點參與；苯丙氨酸代謝有4個苯丙氨酸解氨酶、2個苯丙氨酸氨裂解酶（片段）等12個基因位點參與；類黃酮的生物合成通路有2個含2-酮戊二酸依賴的加氧酶結構域的蛋白質、1個查爾酮異構酶家族蛋白等10個基因位點參與（圖5）。圖6顯示了前20個KEGG富集分析。在前20個顯著富集的KEGG途徑中，有10個途徑處于代謝狀態，10種途徑參與細胞過程。

圖3GO富集圈圖（A）和氣泡圖（B）

2.4實時熒光定量PCR驗證

為了驗證轉錄組測序結果的準確性、可靠性，隨機挑選5個上調基因進行實時熒光定量PCR驗證，結果（表4）顯示，挑選的5個基因在耐鹽處理前后的表達模式與denovo轉錄組測序結果一致。

圖4鹽脅迫下谷子DEG的上調表達KEGG富集

表4實時熒光定量PCR結果

3討論與結論

RNA-Seq可以全面地獲得某一物種特定細胞或組織在某一狀態下的幾乎所有的轉錄本及基因序列，是一種快速、有效鑒定差異表達基因的方法，是揭示植物抗逆機理以及篩選抗逆基因的主要研究技術[13-17]。潘教文等用 NaCl 處理豫谷2號萌發期種子，DEG主要富集在代謝、細胞學過程、細胞組分、生物調節和刺激響應等生物學過程[18]

在鹽脅迫下，滲透壓力和離子毒性的作用會引發次生脅迫，這包括活性氧（ROS）的過量積累。孫國榮等通過測定星星草（Herbaeragrostidis）幼苗在不同濃度 Na₂CO₃ 脅迫下葉綠體內的GST起到了防御ROS的作用[19]。本研究發現編碼谷胱甘肽轉移酶基因TRINITY 、TRINITY_DN1329_-c0_-g2_- i11、TRINITY_DN14419_c1_g1_i1、TRINITY_DN6842_cO_g2_i1、TRINITY_DN10679_cO_g1_i7、TRINITY_DN55_c1_g3_i1、TRINITY_DN33940_cO_g1_i2、TRINITY_DN77307_cO_g1_i1、TRINITY_DN5367_cO_g1_i2、TRINITY_DN14044_cO_g1_i1、TRINITY_DN6842_cO_g3_i2、TRINITY_DN10679_cO_g2_i1和TRINITY_DN55_c1_g2_i1等13個基因，這些基因主要參與細胞色素P450對異種生物的代謝通路、藥物代謝-細胞色素P450通路、谷胱甘肽代謝通路、藥物代謝-其他酶等通路，這些基因在谷子受到鹽脅迫時表達顯著上升，推測它們參與了活性氧清除過程。

轉錄相關蛋白和轉錄因子在耐鹽性中起關鍵作用，在鹽脅迫條件下上調伸長因子有助于維持正常的蛋白質合成以提高耐鹽性[20]。本研究鑒定到的編碼延伸因子 1-α 基因TRINITY_DN4075_c0_gl_il、編碼延伸因子基因1－gammaTRINITY_（204號 和編碼推定伸長因子2基因TRINITY_DN23205_c0_g2_i1上調表達；編碼真核翻譯起始因子3亞基MTRINITY_DN98867_cO_g1_i1上調表達和編碼真核翻譯起始因子4CTRINITY_DN6992_c0_g2_i1下調表達，前人研究發現真核翻譯起始因子5A（eukaryotictranslationinitiationfactor5A，簡稱eIF5A）不僅能夠直接調控蛋白質的合成，還能通過促進某些蛋白質的高效表達，間接調控細胞自噬、核質運輸、mRNA的降解及抵抗環境脅迫等[21]。這些伸長因子和真核翻譯起始因子的變化使谷子能夠維持較高的耐鹽性。

有研究發現，鹽脅迫能夠誘導許多與蛋白質合成相關的蛋白表達量發生變化[22-23]。本研究也鑒定到57個與核糖體蛋白質合成相關的差異表達蛋白，主要包括4OS核糖體蛋白SA（TRINITY_DN3037_cO_g1_i1）60S核糖體蛋白L27a片段（TRINITY_DN3071_c0_g2_i1）、40S核糖體蛋白 S3a （TRINITY_DN29287_c0_g1_i1）40S核糖體蛋白S7（TRINITY_DN9997_c0_g1_i1）60S核糖體蛋白 L7a （TRINITY_DN7632_c0_g1_i1）等基因。在這項研究中蛋白質合成相關蛋白在鹽脅迫下保持較高的數量和活性，與水稻在逆境下核糖體蛋白發生時空調控[24]相一致。

本研究利用RNA-Seq技術檢測到宛谷098鹽脅迫前后倒二葉中1793個差異表達基因（其中上調基因1054個，下調基因739個），主要為細胞質翻譯、細胞質核糖體、核糖體亞基、核糖體的結構成分、依賴SRP的共翻譯蛋白靶向膜等基因。

根據GO注釋分析發現，參與生物過程的基因差異表達最多，其次是細胞組分，而參與分子功能的基因較少；差異基因數量最高的5個GO項分別是細胞質翻譯和依賴SRP的共翻譯蛋白靶向膜2個生物過程，細胞質核糖體和核糖體亞基2個細胞組分，核糖體的結構成分1個分子功能。KEGG代謝途徑富集分析結果表明，DEG主要富集在苯丙氨酸代謝、細胞色素P450對異種生物的代謝、藥物代謝-細胞色素P450、氨基酸和核苷酸糖代謝、谷胱甘肽代謝等代謝途徑和苯丙氨酸的生物合成、類黃酮的生物合成、類胡蘿卜素的生物合成等生物學合成上。

谷胱甘肽轉移酶主要參與細胞色素P450對異種生物的代謝通路、藥物代謝-細胞色素P450通路、谷胱甘肽代謝通路、藥物代謝-其他酶等通路，參與了活性氧清除過程；核糖體蛋白基因家族是調控植物抗逆性的寶貴資源，在植物耐鹽性方面發揮著重要作用。

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