基于多組學(xué)和AlphaFold2對(duì)稻瘟靈防治 稻瘟病菌的靶標(biāo)鑒定

關(guān)鍵詞：稻瘟病菌；稻瘟靈；分子對(duì)接；AlphaFold2；防治靶標(biāo)中圖分類號(hào)： 5435.111.4⁺1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2025）14-0062-08

水稻（OryzasativaL.）作為主要的糧食作物，其產(chǎn)量占我國(guó)糧食總產(chǎn)量的 40% 左右[1]。稻瘟病是威脅水稻生產(chǎn)的重要病害之一，我國(guó)每年由稻瘟病造成的水稻產(chǎn)量損失超過(guò)60萬(wàn) t^[2] 。稻瘟病可發(fā)生在水稻的各個(gè)生長(zhǎng)階段，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成水稻顆粒無(wú)收[3-4]。因此，防治稻瘟病對(duì)于水稻的安全生產(chǎn)具有重要意義。選用抗病品種是預(yù)防稻瘟病發(fā)生最有效的手段之一；但是隨著氣候的變化，病原菌不斷進(jìn)化，并且抗病品種在種植一段時(shí)間后也會(huì)出現(xiàn)抗病性減弱[5]。此外，長(zhǎng)期種植抗病品種在應(yīng)對(duì)突發(fā)的植物病害時(shí)具有巨大缺陷。目前，利用化學(xué)殺菌劑防治稻瘟病依然在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。

稻瘟靈是稻瘟病防治中較為常用且高效的殺菌劑之一。有報(bào)道稱稻瘟靈主要通過(guò)干擾稻瘟病菌的脂質(zhì)代謝發(fā)揮功能[6]。脂質(zhì)代謝對(duì)于稻瘟病菌的生長(zhǎng)和致病至關(guān)重要。其中，稻瘟病菌中的LDP1蛋白對(duì)脂滴形成及利用的調(diào)控是稻瘟病菌發(fā)揮毒力所必需的[7]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，超長(zhǎng)鏈脂肪酸在調(diào)控稻瘟病菌附著胞的形成和定植中具有關(guān)鍵作用[8]。脂質(zhì)代謝在稻瘟病菌生長(zhǎng)和致病中的重要性，使其成為殺菌劑開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵靶標(biāo)。有研究表明，褪黑素能有效抑制稻瘟病菌的脂質(zhì)代謝，通過(guò)對(duì)褪黑素分子的優(yōu)化，能夠使其抑菌效率提高近1000 倍[9]。阿霉素可以靶向稻瘟病菌的 MoPsd2蛋白，干擾稻瘟病菌中糖原、脂滴的形成，顯著降低稻瘟病菌的致病力[10]

當(dāng)前，生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法已成為鑒定病原菌關(guān)鍵靶標(biāo)的重要方式。例如，利用轉(zhuǎn)錄組和突變體篩選鑒定到稻瘟病菌的Mps1蛋白是褪黑素的潛在靶標(biāo)[11]。通過(guò)代謝組學(xué)，鑒定到神經(jīng)酰胺合成的葡萄糖神經(jīng)酰胺是影響稻瘟病菌致病性的關(guān)鍵代謝分子[12]。本研究為了探究稻瘟靈作用于稻瘟病菌的關(guān)鍵功能和潛在靶標(biāo)，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)，分析稻瘟靈對(duì)稻瘟病菌功能的影響，旨在為挖掘潛在的抑菌靶標(biāo)基因奠定基礎(chǔ)，也為稻瘟病的綠色防治提供依據(jù)

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為大麥品種鄂麥9號(hào)。大麥幼苗種植在基質(zhì)-蛭石（體積比 1：1 ）混合土壤中，置于 25～ 30% 溫室中培養(yǎng)，定期澆水，在約1周后1葉1心期即可以使用。使用的稻瘟病菌株為Guy11，將菌塊接種在完全培養(yǎng)基（CM）上，置于 28^°C 培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2稻瘟靈抑菌活性分析

使用商品化的稻瘟靈（Isoprothiolane，IPT，Sigma-Aldrich，#36107）進(jìn)行稻瘟病菌的平板抑菌測(cè)試。首先用二甲基亞砜（Dimethylsulfoxide，DMSO）將稻瘟靈溶解成 10mmol/L 的溶液。分別配制 100mL CM液體培養(yǎng)基進(jìn)行高溫滅菌，隨后將其分別加入已用0.22μm 無(wú)菌濾膜抽濾的稻瘟靈母液，母液體積分別為 500.00，250.00，125.00，62.50，31.25μL ，混勻后倒入平板。隨后將稻瘟病菌接種至含有不同稻瘟靈的CM平板上進(jìn)行培養(yǎng)，5d后對(duì)稻瘟病菌的生長(zhǎng)直徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3稻瘟病菌的接種

使用培養(yǎng)7d的稻瘟病菌進(jìn)行分生孢子的收集，使用含有稻瘟靈的 0.025% 吐溫溶液將孢子懸浮液的濃度調(diào)節(jié)至 10⁵ 個(gè) /mL 。將生長(zhǎng)狀態(tài)一致的大麥葉片剪下并放置在托盤中保濕，將配制好的孢子懸浮液分成每份 10μL 滴至大麥葉片上，至少設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。用保鮮膜密封并置于室溫黑暗條件下培養(yǎng)， 5d 后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析

首先將在CM培養(yǎng)基上培養(yǎng)的稻瘟病菌切成相同大小的菌塊，將菌塊置于CM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d（28%，120r/min） 。隨后分別加入 0.5% DMSO和 10μmol/L IPT處理 24h 后收集菌絲。用液氮將收集的菌絲研磨成粉末，用于RNA提取和代謝組的測(cè)定。轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測(cè)序。通過(guò)Fastp[13]軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾。用Hisat2[14]軟件分別將data 比對(duì)到稻瘟病菌基因組MG8（https：//fungi.ensembl.org/index.html）。使用FeatureCounts[15]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析，得到基因的相對(duì)表達(dá)量。使用DEseq2[16]對(duì)鑒定的基因進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選閾值為 Plt; 0.05， ∣log₂ 差異倍數(shù) |σgt;1σ 。用eggNOG-Mapper[17]（http：//eggnog-mapper.embl.de/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)稻瘟病菌的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，用TBtools[18]進(jìn)行GO^[19] 功能富集分析，用KEGG[20]軟件（https：//www.genome.jp/kegg/）進(jìn)行KEGG的功能分析。

1.5代謝組測(cè)序和分析

代謝組的樣本與轉(zhuǎn)錄組的一致。使用預(yù)冷甲醇/乙腈/水溶液（體積比 2：2：1 ）將研磨好的菌絲粉末進(jìn)行渦旋混合并低溫超聲處理 30min ，于-20^°C 靜置 10min ，再于 離心20min ，取上清液進(jìn)行真空干燥。代謝組測(cè)序委托上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。差異代謝物的篩選標(biāo)準(zhǔn)為正交偏最小二乘法判別分析值（Orthogonal projections to latent structures discriminantanalysis，OPLS-DA） gt;1 ， Plt;0.05 。

1.6 分子對(duì)接

使用AlphaFold2[21]對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。稻瘟靈的結(jié)構(gòu)從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/pccompound/？ term= ）下載。用Autodock[22]對(duì)蛋白質(zhì)和稻瘟靈進(jìn)行分子對(duì)接，用Pymol[23」對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR表達(dá)分析

用TRIzol[24]法對(duì)添加藥劑處理后的稻瘟病菌的菌絲進(jìn)行RNA提取，用HiScriptIIRTSuperMixforqPCR（ +gDNA wiper）進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄，使用ChamQUniversal SYBRqPCRMasterMix進(jìn)行qRT-PCR分析。使用Primer 5^[25] 進(jìn)行定量引物（表1）的設(shè)計(jì)，利用 法計(jì)算基因的表達(dá)差異[26]。

表1使用的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟靈的活性分析

稻瘟靈作為稻瘟病菌的高效殺菌劑，其作用機(jī)制和靶標(biāo)對(duì)于新型綠色殺菌劑的創(chuàng)制具有重要意義。為了探究稻瘟靈的作用機(jī)制，筆者首先從稻瘟病菌和大麥侵染角度評(píng)價(jià)稻瘟靈的抑菌活性（圖1、圖2），分析3．125、6.250、12.500、25.000、50.000μmol/L 稻瘟靈對(duì)稻瘟病菌的抑菌率。圖1-B結(jié)果顯示，上述濃度下的抑菌活性分別為10.8%18.3%38.6%65.3%84.8% 。由于大麥相較于水稻更易感稻瘟病菌，因此大麥常用來(lái)分析稻瘟病菌的致病力[27-28]。在本研究使用含有終濃度為 10μmol/L 稻瘟靈的稻瘟病菌孢子懸浮液對(duì)大麥進(jìn)行侵染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，稻瘟靈能有效抑制稻瘟病菌的侵染（圖3）。結(jié)果顯示，稻瘟靈對(duì)稻瘟病菌的EC₅₀ 為 17.2μmol/L （圖4）。

圖3不同濃度下稻瘟靈處理稻瘟病菌的抑菌率

圖4稻瘟靈抑制稻瘟病菌生長(zhǎng)的半數(shù)效應(yīng)濃度 （EC₅₀）

2.2稻瘟靈抑制稻瘟病菌的轉(zhuǎn)錄組分析

為了探究商用殺菌劑稻瘟靈靶向作用于稻瘟病菌的作用，對(duì)稻瘟靈處理下稻瘟病菌的差異基因進(jìn)行功能分析。差異基因統(tǒng)計(jì)顯示，稻瘟靈處理后，稻瘟病菌中上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)量為1055個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)量為1846個(gè)。隨后分別對(duì)稻瘟病菌的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能、KEGG通路富集分析。稻瘟靈處理稻瘟病菌后，GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)基因主要富集的功能包括磷酸酶活性、腺昔酸轉(zhuǎn)移酶活性、跨膜運(yùn)輸、乳酸代謝、蛋白運(yùn)輸?shù)龋▓D5）；KEGG通路富集發(fā)現(xiàn)，影響的上調(diào)通路包括線粒體生物生成、果糖和甘露糖代謝、甘油酯代謝、脂肪酸降解、能量代謝等（圖6。稻瘟靈處理稻瘟病菌后，GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，下調(diào)基因主要富集的功能包括氧化還原酶活性、酰胺結(jié)合、多糖結(jié)合、碳水化合物代謝 β- 葡萄糖苷酶活性、纖維素代謝等（圖7）；KEGG通路富集發(fā)現(xiàn)，影響的下調(diào)通路包括淀粉和蔗糖代謝、氮、甘油酯代謝、脂質(zhì)、蛋白激酶等（圖8）。

圖2稻瘟靈抑制稻瘟病菌的大麥侵染

2.3稻瘟靈抑制稻瘟病菌的代謝組分析

通過(guò)代謝組分析方法對(duì)稻瘟靈處理的稻瘟病菌的代謝物變化進(jìn)行鑒定，共鑒定到7類代謝物，其中脂質(zhì)類分子數(shù)量最多，約占總數(shù)的 29.19% ，有機(jī)酸數(shù)量約占 28.96% ，有機(jī)雜環(huán)數(shù)量約占 12.16% ，有機(jī)氧、苯類化合物、苯基丙酮類化合物與多酮類化合物數(shù)量分別約占總數(shù)的 9. 40%.7. 63% 、4.76% （圖9）。隨后對(duì)這些代謝物進(jìn)行二級(jí)分類，發(fā)現(xiàn)羧酸及其衍生物、脂肪酸、甘油磷脂、丙烯醇脂質(zhì)、類固醇及類固醇衍生物數(shù)量分別約占代謝物總藍(lán)紅色圖例表示差異基因所富集到的功能的顯著性。藍(lán)至紅色表示顯著性依次增加。圖7同數(shù)的 33.46% .11.99% 、9. 10% 、8. 80% .7.74% （圖10）。對(duì)差異代謝物富集通路上的基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)碳水化合物、氨基酸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、鞘脂代謝等相關(guān)代謝物數(shù)目最多，其中鞘脂代謝、脂質(zhì)、碳水化合物數(shù)量在稻瘟病菌中下調(diào)表達(dá)（圖11）。對(duì)差異代謝物進(jìn)行表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)稻瘟靈處理組和對(duì)照組的組內(nèi)重復(fù)性一致，其中稻瘟靈處理組的下調(diào)差異代謝物數(shù)量遠(yuǎn)高于對(duì)照組（圖12）。上述結(jié)果表明，稻瘟靈處理造成稻瘟病菌代謝物合成受阻。

圖5稻瘟靈處理稻瘟病菌的上調(diào)基因的GO功能富集

圖6稻瘟靈處理稻瘟病菌的上調(diào)基因的KEGG通路富集

圖7稻瘟靈處理稻瘟病菌的下調(diào)基因的GO功能富集

圖9稻瘟靈處理稻瘟病菌的代謝物一級(jí)分類

圖10稻瘟靈處理稻瘟病菌的代謝物二級(jí)分類

2.4稻瘟靈的核心靶標(biāo)篩選

對(duì)用稻瘟靈處理的稻瘟病菌的差異表達(dá)基因和差異代謝物進(jìn)行相關(guān)性分析，構(gòu)建稻瘟靈處理稻瘟病菌的轉(zhuǎn)錄-代謝共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明，有1個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的代謝物與差異表達(dá)基因高度相關(guān)（圖13）。相關(guān)性表達(dá)熱圖表明，差異基因與差異代謝物表達(dá)模式呈正相關(guān)的集合多于呈負(fù)相關(guān)的集合（圖14）。隨后在共表達(dá)網(wǎng)路中篩選稻瘟靈在稻瘟病菌中的潛在靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)MGG_00435編碼的膜蛋白 $＼ 、 M G G ＼_ O 5 4 3 3$ 編碼的溶質(zhì)運(yùn)載家族6蛋白和MGG_08424編碼的 ^1，4-β- 木聚糖內(nèi)切酶3個(gè)脂質(zhì)相關(guān)基因在網(wǎng)絡(luò)中高度相關(guān)。對(duì)稻瘟靈處理前后的稻瘟病菌基因MGG_00435、MGG_05433、MGG_08424進(jìn)行定量檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)稻瘟靈處理 24h 后，稻瘟病菌中的MGG_00435、MGG_05433、MGG_08424基因的相對(duì)表達(dá)量相較于對(duì)照組均顯著下降，分別降低 47.7%7.3%.69.5% ，這與轉(zhuǎn)錄組分析到的表達(dá)趨勢(shì)一致（圖15）。用分子對(duì)接方法分析上述3個(gè)蛋白與稻瘟靈的結(jié)合能力，結(jié)果顯示，稻瘟靈可與MGG_00435編碼的膜蛋白和MGG_05433編碼的溶質(zhì)運(yùn)載家族6蛋白結(jié)合，而與""編碼的^1，4-β-"木聚糖內(nèi)切酶不存在結(jié)合現(xiàn)象（圖16）。上述結(jié)果表明，MGG_00435編碼的膜蛋白和 MGG_-"05433編碼的溶質(zhì)運(yùn)載家族6蛋白可能與稻瘟靈結(jié)合。

圖11稻瘟靈處理稻瘟病菌的差異代謝物KEGG通路分析

圖12稻瘟靈處理稻瘟病菌的差異代謝物的表達(dá)模式

圖13稻瘟靈處理稻瘟病菌的差異基因和代謝物的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

圖14稻瘟靈處理稻瘟病菌的差異基因和代謝物的表達(dá)模式

使用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， ??? 表示在0.001水平差異顯著，****表示在0.0001水平差異顯著

圖15qRT-PCR分析稻瘟靈處理的稻瘟病菌基因的相對(duì)表達(dá)量

3討論

作物病害是影響作物生產(chǎn)和品質(zhì)的關(guān)鍵因素，每年用于病害防控的殺菌劑預(yù)計(jì)可達(dá)200萬(wàn)t，對(duì)動(dòng)植物的生存造成了一定威脅[29]。稻瘟靈作為低毒高效的稻瘟病菌殺菌劑，在稻瘟病的防控中發(fā)揮重要作用。本研究利用多組學(xué)、分子對(duì)接方法探究稻瘟靈對(duì)稻瘟病菌的影響。稻瘟靈對(duì)稻瘟病菌有極好的抑菌活性，其中稻瘟靈的 EC₅₀ 約為 21.3μmol/L^[6] ，這與本研究結(jié)果相似。本研究通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，稻瘟靈對(duì)稻瘟病菌的基因和代謝水平均存在顯著影響。通過(guò)GO功能富集和KEGG通路富集發(fā)現(xiàn)，稻瘟靈影響稻瘟病菌的磷酸酶活性、腺苷酸轉(zhuǎn)移酶活性、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化還原酶活性、酰胺結(jié)合、淀粉和糖代謝、氮、甘油酯代謝以及脂質(zhì)、碳水化合物代謝、β- 葡萄糖昔酶活性、纖維素代謝等。通過(guò)代謝組分析，發(fā)現(xiàn)脂肪酸、磷脂、脂質(zhì)等相關(guān)差異代謝物顯著富集。研究結(jié)果表明，稻瘟靈處理嚴(yán)重影響了稻瘟病菌的脂質(zhì)代謝。有研究發(fā)現(xiàn)，在稻瘟病菌中敲除心脂質(zhì)通路的關(guān)鍵酶基因MoGep4能降低其致病力，通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)，靶向MoGep4的藥物阿來(lái)西定二鹽酸鹽能有效抑制稻瘟病菌侵染水稻[30]

圖16稻瘟靈和稻瘟病菌潛在靶標(biāo)的分子對(duì)接

本研究也鑒定到MGG_00435編碼的膜蛋白和MGG_05433編碼的脂質(zhì)運(yùn)載家族6蛋白可能是稻瘟靈的潛在靶標(biāo)。膜蛋白、脂質(zhì)在稻瘟病菌的生長(zhǎng)和致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。稻瘟病菌與膜相關(guān)的基因Moemc5突變體的致病力相對(duì)于野生型而言顯著降低，導(dǎo)致附著孢無(wú)法侵人水稻細(xì)胞，同時(shí)MoEmc2被鑒定發(fā)現(xiàn)調(diào)控對(duì)酪蛋白激酶MoCk2對(duì)MoRgs1的磷酸化，參與稻瘟病菌功能性附著胞的形成和致病力[31]。通過(guò)靶向脂質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)，MoVast2聯(lián)合MoVast1共同調(diào)控細(xì)胞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和自噬，參與稻瘟病菌侵染水稻[32]

利用病原菌的致病機(jī)制開(kāi)發(fā)殺菌劑已經(jīng)成為當(dāng)前創(chuàng)制綠色殺菌劑的重要信息來(lái)源。基于超長(zhǎng)碳鏈脂肪酸發(fā)現(xiàn)的抑制劑能有效抑制septin環(huán)的形成，從而降低稻瘟病菌的致病性，且不會(huì)對(duì)水稻宿主造成傷害[8]。基于稻瘟病菌的特異性和保守性毒性效應(yīng)蛋白MoErs1抑制水稻半胱氨酸酶OsRD21免疫活性的機(jī)制，設(shè)計(jì)出的二苯醚酯類化合物能有效抵抗稻瘟病菌的侵染[33]。綜上所述，本研究通過(guò)多組學(xué)分析高效殺菌劑稻瘟靈對(duì)稻瘟病的影響，鑒定到多個(gè)稻瘟靈的潛在殺菌靶標(biāo)。

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