140份葡萄種質對白腐病的抗性鑒定和評價

關鍵詞：葡萄；白腐病；白腐墊殼孢菌；抗病性；過氧化物酶；多酚氧化酶；活性中圖分類號： S436.631.1⁺3 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）14-0148-06

葡萄是世界范圍內廣泛栽培的水果之一，我國葡萄產業近年來發展迅速。據聯合國糧農組織（FAO）統計數據，2022年我國葡萄產量為1537.5萬t，居世界首位。在葡萄生產中，病害是嚴重影響葡萄產量和品質的重要因素，其中白腐病是葡萄主要病害之一，可危害葡萄多個部位。植株葉片邊緣受侵染后，常出現水漬狀褐色病斑，病斑逐漸擴大呈圓形，有褐色輪紋并在葉片表面產生白色分生孢子器，后期葉片干枯后常穿孔破裂[1-2]。病斑隨即蔓延至果梗和果粒，使果粒變成褐色軟腐狀，后期會在穗軸和果實表面形成顆粒狀灰色分生孢子器；當外界環境濕度較大時，形成黑色黏稠狀分生孢子堆，并伴隨著土腥味，發病果粒最終干癟變為僵果，造成葡萄產量嚴重下降[2-3]

葡萄白腐病的病原菌主要有ConielladiplodiellaC.fragariae C.castaneicola 和 C. vitis[4-6]。Chethana等明確了C.vitis是我國白腐病的主要病原菌[]；袁麗芳等對山東省葡萄白腐病菌進行了鑒定，結果也表明C.vitis為致病菌[8]。長期以來，生產中主要使用化學藥劑防治葡萄白腐病，常用藥劑主要包括甲基硫菌靈、百菌清、福美雙、代森錳鋅等單劑或混劑，長期單一使用會使病原菌產生抗藥性[9-10]。梁春浩等建立了葡萄白腐病菌對多菌靈的敏感基線，評價了該病菌對多菌靈的敏感性，證明病菌對多菌靈有較強的潛在抗藥風險[];李寶燕等建立了白腐病菌對抑霉唑的敏感基線，與敏感基線比較，田間已出現對抑霉唑低抗的菌株[12]。雖然白腐病菌對吡唑醚菌酯、戊唑醇等部分藥劑表現敏感，但因白腐病菌田間變異速度快，對農藥產生抗性的概率加大，需加強田間病原菌抗性監測[13]。筆者團隊先前的研究表明，新型材料微納鋅在室內平板試驗條件下對白腐病菌具有較好的抑制作用，但田間防效仍有待于觀察和驗證[14]

選用抗白腐病葡萄品種是防治該病害的根本途徑。目前普遍認為，東亞種群和歐美種群葡萄對白腐病抗性較強，而歐亞種葡萄抗性較差[15]。野生葡萄種質是珍貴的抗性材料，研究者發現在田間自然環境下，所有野生葡萄均不感染白腐病；室內離體鑒定條件下，也篩選出一批對白腐病高抗的品種，主要有刺葡萄、山葡萄等，但目前還未發現對白腐病完全免疫的種質[16-17]。因此，本研究系統地對140份葡萄種質進行白腐病抗性鑒定和評價，明確其抗性水平，為葡萄育種工作提供理論基礎。

1材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料：本試驗以140份葡萄種質為試材，材料均來源于江蘇省農業科學院溧水植物科學基地葡萄種質資源圃，包括中國野生山葡萄1份、歐亞種質78份、歐美種質51份、歐山雜交種2份、東亞種質4份、圓葉葡萄2份以及部分砧木品種。

供試菌株：葡萄白腐病菌，分離自江蘇省農業科學院溧水植物科學基地發病葡萄果實樣品，鑒定后保存于筆者所在課題組的實驗室。白腐病菌為專性寄生，可離體培養于PDA培養基上， 26^°C 黑暗條件下培養3d，待菌絲布滿平板時取出，置于 4‰ 冰箱保存備用。

1.2 試驗時間

本試驗于2023年7月至2024年8月在的分子實驗室完成。

1.3 試驗方法

1.3.1葡萄白腐病菌分離鑒定采集田間疑似白腐病的發病葡萄葉片和果實，清水沖洗后再用無菌水沖洗2次，用手術刀在病健交界處劃取小塊病組織，首先置于 3% 次氯酸鈉溶液中消毒 1～2min ，然后置于 75% 乙醇中消毒 30s ，最后用無菌水沖洗2遍，用無菌濾紙擦干后置于PDA培養基上， 26°C 黑暗條件下培養3d，觀察菌落形態進行初步鑒定[7-8]。同時利用分子生物學手段進一步明確病原菌種類，具體操作方法為：用無菌牙簽在培養好的菌落邊緣取小塊菌絲塊放于 50mL PDB液體培養中，置于 26°C 、轉速 180r/min 的搖床培養 24～ ^48h ，過濾后取適量菌絲體；利用真菌基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取病原菌基因組DNA，選擇ITS1、ITS4引物（引物序列 5^′- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA- ?3^′，5^′ -TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3^′ ）擴增DNA，將擴增產物送至通用生物股份有限公司測序；將測序結果在NCBI數據庫中與已發表的基因進行同源性比對，利用MEGA11.0軟件采用鄰接法構建系統發育樹，Bootstrap 為1000 次。

1.3.2葡萄種質白腐病抗性鑒定采用室內離體葉片有傷接種法對葡萄種質進行白腐病抗性鑒定。具體操作參照張穎等的方法[16]并稍作改動：采集各品種當年生枝條上第4～6張成齡葉片，用流動無菌水沖洗干凈并擦干后待用;用接種針在每個葉片正面針刺2～4個傷口（避開主脈），每個傷口接種直徑為 5mm 的菌絲塊，每個品種接種3張葉片，并設3次生物學重復；接種后的葉片置于培養皿中，培養皿上覆蓋浸濕但不滴水的雙層濾紙進行保濕，封口膜密封后置于條件為 光照 ^/8h 黑暗的光照培養箱中培養，培養 24h 后移去菌絲塊，繼續培養 ^48h 后記錄、統計發病情況

采用十字交叉法統計病斑大小，利用ImageJ軟件計算病斑面積占葉面積的百分比，根據百分比將葡萄白腐病病癥劃分為7個等級（表1）。

表1葡萄白腐病病癥等級劃分標準

病癥等級轉化為病情指數 （DI） ），計算公式如下：

根據病情指數，抗性分為5級： DI?5.0 為高抗（HR） ;5. 0 70.0為高感（HS）。

1.3.3感病后不同葡萄種質葉片酶活性測定采用有傷接種法分別接種高抗種質雙優和高感種質紅地球，每個處理接種3張葉片，設3次重復，取樣時間為接種后 0，12，24，36，48，72h 。過氧化物酶和多酚氧化酶分別使用北京索萊寶科技有限公司生產的過氧化物酶活性檢測試劑盒（微量法）和多酚氧化酶活性檢測試劑盒（微量法）進行測定。

1.3.4統計及分析方法采用MicrosoftExcel2016軟件對數據進行處理，采用SPSS23.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1病原菌鑒定結果

從發病果實和葉片中共分離純化得到3株白腐病菌，形態學初步鑒定為Coniellasp.。利用rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4擴增3株病原菌的DNA序列，對擴增結果進行雙向測序，測得3株菌株的rDNA-ITS序列均為 559bp ，將測序結果在NCBI數據庫上與已發表的基因進行同源性比對，并利用MEGA11.0軟件構建系統發育樹。結果（圖1）表明，這3株白腐病菌株的rDNA-ITS序列與登錄號為MH356592.1、OR911603.1的白腐墊殼孢菌（Coniellavitis）聚在同一分支，說明3株菌株均為C.vitis。結合形態學鑒定和分子生物學鑒定，最終鑒定3株菌株均為C.viis，為江蘇葡萄白腐病的致病菌。

圖1分離的3株白腐病菌系統發育樹

2.2葡萄種質對白腐病的抗性分析

采用強致病性菌株WR-1作為試驗菌株，有傷離體接種3d后，采用雙十字法統計每個種質發病葉片的病斑直徑，并將病斑直徑轉換成病情指數，按照病情指數分級標準統計抗性類型。結果（表2）表明，供試的中國野生葡萄、歐亞種、歐美種等共140份葡萄種質中均不存在免疫類型;共鑒定出高抗種質3份，分別為中國野生山葡萄雙優、歐山雜種北冰紅和雙紅，病情指數分別為3.66、3.62、4.42；中抗種質共15份，其中包括阿達玫瑰、白馬拉加、矢富羅莎等歐亞種9份，巨玫瑰、希姆勞特、峰后等歐美種質6份；抗病種質、感病種質和高感種質數量分別為21份、72份、29份，其中抗性種質中歐美種質占比為 66.67% ，高感種質中歐亞種質占比為 72.41% 。這與前人研究歐美種抗病性強、歐亞種抗性差的結論一致。

2.3接種葡萄白腐病菌后不同種質葉片過氧化物酶活性動態變化

由圖2可知，白腐病菌的侵染影響葡萄葉片過氧化物酶活性，與對照相比，不同品種的過氧化物酶活性在接種病原菌后均明顯升高，且不同抗性品種間差異顯著。高抗品種雙優葡萄葉片過氧化物酶活性在接種后 12h 顯著升高;接種后 ^36h 時其活性達到最高，為 ；接種后 48h 開始下降，但其活性仍顯著高于雙優-對照；接種后 ^72h 其活性降低至對照水平。感病葡萄品種紅地球葉片過氧化物酶活性變化趨勢與雙優大致相同，接種后 ^12h 顯著升高；接種后 ^48h 其活性才達到最高，為1.88U/（ g?min） ；其反應時間比雙優葡萄長，且過氧化物酶活性在接種 12～36h 間顯著低于雙優；接種后 ^72h 其活性仍高于對照水平。

表2（續）

2.4接種葡萄白腐病菌后不同品種葉片多酚氧化酶活性動態變化

不同葡萄品種接種白腐病菌后葉片多酚氧化酶活性的變化如圖3所示。接種后 ^12h ，抗病品種雙優的多酚氧化酶活性顯著增加，在接種后 12～ 36h 間持續升高；接種 ^36h 時其活性達到最高，為6.39U/（g?min） ，是雙優-對照的4.92倍；雖然接種 ^48h 后開始下降，但仍顯著高于雙優-對照；接種 ^72h 后與雙優-對照無顯著差異。與抗性品種雙優相比，紅地球的多酚氧化酶活性在接種 36h 后才顯著增加，接種 ^48h 后開始下降，但仍顯著高于紅地球-對照;其他時間與紅地球-對照無顯著差異。

3討論與結論

白腐病是目前葡萄生產上的主要真菌性病害之一，其平均可造成葡萄減產 16% [5]。近年來，葡萄白腐病在江蘇省普遍發生，且有逐年加重的趨勢，導致葡萄產量和品質嚴重下降，對江蘇葡萄產業造成重大的經濟損失[14]。近期研究表明，我國河北、山東、廣西和北京等地的葡萄白腐病病原菌均為 ，目前引起江蘇省葡萄白腐病的病原菌還未明確。明確病原菌的種類，可有針對性地使用有效化學藥劑進行科學防治。本研究采集感染白腐病的病果和病葉，經分離純化后共獲得3株白腐病菌株，利用ITS1/ITS4通用引物擴增獲得其ITS區域DNA序列，并構建系統發育樹。結果表明，3株菌株均和C.vitis聚于同一分支，說明3株菌株均為C.vitis，因此可針對性地選擇未產生抗藥性的殺菌劑進行科學防控。

我國葡萄種植區域覆蓋了全國各省區，且品種區域多樣性顯著，了解不同葡萄品種對白腐病的抗性，可為葡萄引種、抗病品種推廣以及育種工作中親本選擇提供理論支持。本研究系統評價了140份不同葡萄種質對白腐病的抗性，發現中國野生山葡萄雙優、歐山雜種北冰紅和雙紅對白腐病呈現高抗特性，這與劉麗婷等的研究結果[3]一致。張穎等的研究表明，歐亞種葡萄在離體鑒定中抗性主要分布于高感至抗病范圍，沒有高抗類型，且大多屬于感病和高感[18]。本研究中共78 份歐亞種葡萄種質，其中抗性類型為感病、高感的占比為 79.49% ，表明歐亞種葡萄普遍易感白腐病。本研究還發現，不論是歐亞種葡萄還是歐美種葡萄，其種間抗性都存在很大差異，如歐美雜種中存在抗病、中抗、感病和高感4種類型，歐亞種葡萄同樣也存在上述4種抗病類型，本研究結果可為不同育種需求提供理論依據。

植物在受到病原菌侵染時，其體內活性氧代謝會受到脅迫，導致代謝失調。此時植物體內的防御酶系統會快速啟動來應對病原菌產生的傷害，過氧化物酶和多酚氧化酶是植物體內主要的活性氧清除酶[19-21]。在接種白腐病菌后，雙優和紅地球葉片過氧化物酶活性均表現為先升高后降低，但雙優響應速度快于紅地球，在接種 ^12h 后就顯著高于對照，并且響應幅度也高于紅地球，在 12～36h 內酶活性均顯著高于紅地球，說明在遇到病害侵染時，高抗材料的過氧化物酶活性響應速度和幅度均優于感病材料。同樣的，在接種白腐病菌后，2個葡萄種質的多酚氧化酶活性均有顯著提高，抗病材料的多酚氧化酶活性峰值和響應速度均優于感病材料。本研究結果表明，雙優具有較高抗性的原因可能是其體內的保護酶系統對病原菌的反應速度和強度均優于感病材料，在遇到病原物侵染時，能及時做出防御反應，抵抗病原菌的侵染。

本研究對江蘇省葡萄白腐病病原菌進行了鑒定，確定致病菌為C.vitis。對140份葡萄種質進行白腐病抗性鑒定，篩選出包括中國野生山葡萄雙優在內的高抗種質3份，歐美種葡萄抗性普遍優于歐亞種葡萄，這與前人研究結果一致。酶活測定結果表明，高抗種質雙優的過氧化物酶和多酚氧化酶反應速度和幅度均優于感病種質紅地球，這可能是其抗性高的主要原因。

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