唐山市某牛場(chǎng)奶牛球蟲(chóng)的分離與鑒定

牛球蟲(chóng)病是由于牛感染了艾美耳球蟲(chóng)而引發(fā)的以腹瀉為臨床癥狀的牛腸道原蟲(chóng)疾病。犢牛最易受到感染，因此牛球蟲(chóng)病也是幼齡奶牛腹瀉的病因之一。艾美耳球蟲(chóng)屬于直接發(fā)育型，其卵囊形態(tài)為橢圓或近似于圓形，卵壁光滑。球蟲(chóng)直接發(fā)育不需要借助中間的宿主來(lái)發(fā)育生長(zhǎng)。在我國(guó)已發(fā)現(xiàn)牛球蟲(chóng)病原有16種，其中牛艾美耳球蟲(chóng)和邱氏艾美耳球蟲(chóng)的致病力最強(qiáng)，是引起牛球蟲(chóng)病的主要病原[1]。球蟲(chóng)病的傳播多為攜帶球蟲(chóng)的奶牛排出的糞便中含有艾美耳球蟲(chóng)，糞便污染養(yǎng)殖場(chǎng)奶牛圈舍的環(huán)境以及飲水和飼料，再被其他奶牛通過(guò)口食飼料或飲水進(jìn)入體內(nèi)[2]。球蟲(chóng)病的傳播也與外界的氣溫氣候濕度條件有很大的關(guān)系，具有典型的季節(jié)性特征[3]。在氣候溫暖多雨的春夏秋三個(gè)季節(jié)最易暴發(fā)，特別是在多雨的季節(jié)[4。基于疾病的發(fā)展速度和臨床表現(xiàn)，牛球蟲(chóng)病可被分為兩大類(lèi)型：急性型和慢性型[5]。急性型病癥通常在10～15d內(nèi)顯現(xiàn)，初期病牛會(huì)表現(xiàn)出抑郁、毛發(fā)比較松亂、體溫略微有升高的情況。1周后病情開(kāi)始加重，奶牛呈現(xiàn)出明顯的無(wú)精打采、體重肉眼可見(jiàn)的下降，并且體溫會(huì)升至40℃左右。奶牛胃腸的蠕動(dòng)可能會(huì)暫停，排泄物會(huì)變成帶有血的稀便并伴有惡臭，在疾病晚期，糞便呈現(xiàn)黑色，糞便中帶血液，最終奶牛因嚴(yán)重的貧血導(dǎo)致死亡[。相比之下，慢性型的牛在發(fā)病3～5d后會(huì)有所改善，但持續(xù)的腹瀉依然存在，并持續(xù)伴有貧血癥狀，這個(gè)情況可能會(huì)持續(xù)數(shù)月，最終奶牛會(huì)因?yàn)閲?yán)重的貧血消瘦而死亡[]。牛球蟲(chóng)病已經(jīng)嚴(yán)重危害動(dòng)物健康，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[

為了解唐山市某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)球蟲(chóng)感染情況，本研究采用飽和食鹽水漂浮法、形態(tài)觀察法分離并鑒定該牛場(chǎng)的球蟲(chóng)種類(lèi)。本研究結(jié)果為該牛場(chǎng)球蟲(chóng)病的治療提供科學(xué)依據(jù)，制定有效的防控措施，以減少該病的傳播，降低經(jīng)濟(jì)損失，保障其健康穩(wěn)定發(fā)展。

1材料

1.1試驗(yàn)樣品

2024年11月一2025年3月采集唐山市某奶牛場(chǎng)腹瀉牛新鮮糞便，共計(jì)50份樣品。將采集樣品置于樣品保存袋中，每一份樣品需標(biāo)注采集地點(diǎn)、采集時(shí)間、動(dòng)物種類(lèi)、動(dòng)物年齡、糞便性狀等詳細(xì)資料。每一份樣品稱重 100g ，置于 4^°C 冰箱內(nèi)保存。

1.2主要試劑和儀器

NaC1購(gòu)自天津市北辰方正試劑廠；重鉻酸鉀購(gòu)自河南揚(yáng)子化工有限公司；60目銅絲篩購(gòu)自上海豐行篩網(wǎng)制造有限公司；雙目生物顯微鏡購(gòu)自上光儀器有限公司；臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自常州國(guó)華電器有限公司。

1.3主要溶液的配制

飽和食鹽水溶液：在燒杯中稱取400g食鹽，隨后向燒杯內(nèi)加入 1000mL 蒸餾水，將燒杯置于熱源上加熱，不斷攪拌直至食鹽完全溶解，等待其自然冷卻至室溫，若在冷卻過(guò)程中觀察到少量食鹽析出，即為飽和食鹽水。

2.5% 重鉻溶液：在燒杯中稱取25g重鉻酸鉀固體，隨后向燒杯中加入預(yù)先煮沸的蒸餾水至 1000mL 刻度線處，充分?jǐn)嚢?，確保重鉻酸鉀完全溶解，制備完成后，將其置于室溫下保存，即為 2.5% 重鉻酸鉀溶液。

2方法

2.1球蟲(chóng)卵囊的收集

本研究利用飽和食鹽水漂浮法收集奶牛球蟲(chóng)卵囊：將采集的奶牛新鮮糞便樣品加入2倍體積的自來(lái)水，混勻后使用60目銅絲篩對(duì)混合液進(jìn)行過(guò)濾，收集含有球蟲(chóng)卵囊的濾液濾渣。對(duì)濾渣重復(fù)三次相同操作，棄去濾渣收集濾液。濾液靜置3h棄去上清液后充分?jǐn)嚢?，形成混懸液，?jīng)過(guò)3 500r/min 離心5min ，棄上清液，保留沉淀。向沉淀中加入適量飽和食鹽水，形成混懸液，離心保留上清液，棄去沉淀。將含有卵囊的上清液加入3倍體積的自來(lái)水混合后離心收集沉淀，所得沉淀即為球蟲(chóng)卵囊。

2.2球蟲(chóng)卵囊的孢子化培養(yǎng)

將分離得到的球蟲(chóng)卵囊沉淀轉(zhuǎn)移至干凈的平Ⅲ（深度不超過(guò) 1cm ）中，進(jìn)行球蟲(chóng)卵囊的孢子化培養(yǎng)，向含有球蟲(chóng)卵囊沉淀物的平血內(nèi)加入 2.5% 重鉻酸鉀溶液，為確保孢子化過(guò)程順利進(jìn)行，平血須保持敞口狀態(tài)，以維持氣體交換。將平血放入設(shè)定為28^°C 的恒溫培養(yǎng)箱中，保持通氣狀態(tài)，為球蟲(chóng)卵囊孢子化培養(yǎng)提供最優(yōu)的環(huán)境條件。在培養(yǎng)孢子化球蟲(chóng)卵囊期間，無(wú)法避免平血內(nèi)重鉻酸鉀溶液中的水分被蒸發(fā)，因此需要定期向平血中添加28 C 的蒸餾水，以保證培養(yǎng)溶液高度始終在合適的范圍內(nèi)。在孢子化培養(yǎng)24h后，需要每12小時(shí)對(duì)孢子化培養(yǎng)的卵囊進(jìn)行檢查，以監(jiān)測(cè)其生長(zhǎng)和孢子化情況。經(jīng)過(guò)2～3d，當(dāng)觀察到 80% 以上的球蟲(chóng)卵囊完成孢子化后，從培養(yǎng)箱中取出，置于 4^°C 的冰箱中保存，待檢。

2.3球蟲(chóng)蟲(chóng)種的鑒定

通過(guò)制片觀察，在400倍顯微鏡下，隨機(jī)對(duì)40個(gè)未孢子化卵囊進(jìn)行鏡檢。觀察所得的卵囊照片中卵囊的大小、形態(tài)以及結(jié)構(gòu)特征，并對(duì)這些特征進(jìn)行了詳細(xì)地記錄。隨機(jī)檢測(cè)40個(gè)孢子化卵囊，記錄其中孢子囊的形態(tài)大小，完成孢子化所需的時(shí)間等數(shù)據(jù)，為后續(xù)的分析提供重要的依據(jù)。將所有測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總，并參照相關(guān)文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)奶牛球蟲(chóng)蟲(chóng)種進(jìn)行鑒定。

3結(jié)果與分析

3.1球蟲(chóng)卵囊分離鑒定結(jié)果

如圖1所示，可觀察到其特征，卵囊呈橢圓形，卵囊壁分為內(nèi)外兩層，呈黃綠色，大小為 22.10μm×15.30μm_o 卵囊內(nèi)含有四個(gè)孢子囊，每一個(gè)孢子囊中含有兩個(gè)子孢子，卵囊尖端處有卵膜孔。如圖2所示，可觀察未孢子化卵囊特征，卵囊呈橢圓形，其卵囊壁結(jié)構(gòu)分明，分為內(nèi)外兩層，卵囊壁整體呈深黃色，內(nèi)壁為淡褐色，箭頭所示為球蟲(chóng)未孢子化卵囊。詳見(jiàn)圖1-2。

3.2球蟲(chóng)種類(lèi)的鑒定

隨機(jī)測(cè)量40個(gè)未孢子化卵囊和40個(gè)已孢子化卵囊中的孢子囊的大小，數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

與所查閱的資料和文獻(xiàn)中未孢子化卵囊和已孢子化卵囊的孢子囊大小的數(shù)據(jù)比較，本研究測(cè)得的數(shù)據(jù)在資料范圍內(nèi)，結(jié)果見(jiàn)表2。研究結(jié)果表明，分離出的球蟲(chóng)是牛艾美耳球蟲(chóng)。

4討論

本研究采用飽和食鹽水漂浮法進(jìn)行球蟲(chóng)卵囊的分離，此方法操作簡(jiǎn)便、成功率高，但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需注意傾倒上清液、轉(zhuǎn)移混懸液等步驟，要嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)操作流程，防止球蟲(chóng)卵囊丟失；離心后應(yīng)仔細(xì)檢查離心管內(nèi)的液面，防止由于轉(zhuǎn)數(shù)不足或離心時(shí)間不夠?qū)е孪x(chóng)體沒(méi)有完全存在于某一液層中造成卵囊的丟失。雖然有研究認(rèn)為，飽和食鹽水漂浮法的處理對(duì)卵囊的活力無(wú)顯著性影響[14]。但是由于未孢子化的球蟲(chóng)卵囊相較于孢子化的球蟲(chóng)卵囊對(duì)外界環(huán)境的刺激更加敏感，龔振興等[15研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用飽和食鹽水對(duì)未孢子化的球蟲(chóng)卵囊進(jìn)行處理過(guò)程中，若處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)對(duì)未孢子化卵囊造成一定程度的損傷，這種損傷會(huì)對(duì)后續(xù)的孢子化發(fā)育過(guò)程產(chǎn)生不利影響。由此可知，接觸的時(shí)間增加，可能將導(dǎo)致卵囊的孢子化率下降。因此在利用飽和食鹽水漂浮法收集球蟲(chóng)卵囊時(shí)需注意，應(yīng)嚴(yán)格限制飽和食鹽水與球蟲(chóng)卵囊的接觸時(shí)間，確保接觸時(shí)間控制在 30min 內(nèi)。

表1卵囊和孢子囊大小測(cè)量數(shù)據(jù)

表2測(cè)量結(jié)果匯總

圖1孢子化的球蟲(chóng)卵囊

卵囊大小是球蟲(chóng)種類(lèi)鑒定的重要指標(biāo)，為使測(cè)量數(shù)據(jù)具有代表性，本研究隨機(jī)選取40個(gè)未孢子化卵囊和40個(gè)孢子化卵囊的孢子囊，根據(jù)其大小、形態(tài)等方面進(jìn)行判斷。利用飽和食鹽水漂浮法分離得到的球蟲(chóng)卵囊，在生物顯微鏡下直接鏡檢，形態(tài)學(xué)觀察本研究獲得的牛艾美耳球蟲(chóng)卵囊為橢圓形，卵囊壁分為內(nèi)外兩層，呈黃綠色，卵囊大小范圍為（ 21.10～28.50 ） μm×（15.00～20.60） μm ，與曹希亮等[1]、張曉東等[1]、張龍現(xiàn)等[12]、趙其平等[12]報(bào)道的牛艾美耳球蟲(chóng)卵囊形態(tài)特征相似。已孢子化卵囊中的孢子囊大小范圍為（ 12.20～17.50 ） μm× 0 5.10～7.60 ） μm ，與張龍現(xiàn)等12報(bào)道的孢子囊大小數(shù)值范圍相符。

結(jié)語(yǔ)

本研究通過(guò)對(duì)唐山市某牛場(chǎng)奶牛球蟲(chóng)的分離與鑒定，明確了該牛場(chǎng)奶牛球蟲(chóng)的感染種類(lèi)、形態(tài)特征及感染情況，為牛場(chǎng)球蟲(chóng)病的防控提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。研究過(guò)程中，采用飽和鹽水漂浮法和顯微鏡檢查等技術(shù)，成功分離出目標(biāo)球蟲(chóng)卵囊。從研究結(jié)果來(lái)看，該牛場(chǎng)存在一定程度的奶牛球蟲(chóng)感染，提示球蟲(chóng)病可能是影響奶牛健康和生產(chǎn)性能的潛在因素之一。這一發(fā)現(xiàn)為牛場(chǎng)制定針對(duì)性防控措施提供了科學(xué)依據(jù)，可有效降低球蟲(chóng)感染風(fēng)險(xiǎn)，保障奶牛養(yǎng)殖效益。

圖2未孢子化的球蟲(chóng)卵囊和孢子化的球蟲(chóng)卵囊

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收稿日期：2025-06-23

作者簡(jiǎn)介：王小月（1995一），女，漢族，碩士，獸醫(yī)師。研究方向：動(dòng)物疫病診斷與防控。*通訊作者：董李學(xué)（1984—），男，漢族，碩士，研究員。研究方向：動(dòng)物疫病診斷與防控。