熒光定量PCR篩查脊髓性肌萎縮癥基因攜帶孕婦的效果觀察

Doi：10.3969/j.issn.1673—5293.2025.08.010

[中圖分類號]R173 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1673—5293（2025）08—0061—06

Effect of quantitative fluorescent PCR on screening pregnant women carrying spinal muscular atrophy gene

LUOXiuxia，LUOQin，LIUWeichou，XIEXiaoyan，ZHU Zinian （Department of Laboratory Medicine，Dongguan People's Hospital，Guangdong Dongguan 523Ooo，China）

[Abstract]Objective Toevaluate theeffectivenessof quantitative fluorescent polymerase chainreaction（PCR）inscreening pregnant women for spinal muscular atrophy（SMA）gene carrer status.Methods A retrospective analysis was conducted on peripheralbloodsamplesfrom 6OOpregnant women whovoluntarilyunderwent SMAscreeningatourhospital betweenOctober 2022andApril 2023.Multiplex ligation-dependent probeamplication（MLPA）andquantitativefluorescent PCRwereusedto detect SMA gene carrerstatus.MLPA servedas the gold standard toassessthe accuracyofquantitativefluorescent PCR.Results MLPAanalysisidentified 60cariersamong the6pregnant women，comprising 50cases with1genecopyofboth SMNlexon7 and exon 8，9 cases with only SMNl exon 8 heterozygous deletion，andl case withonly SMN1 exon7 heterozygous deletion，while 540casesshowed2 genecopies ofboth exon7and exon8of SMN1.Quantitativefluorescent PCR indicatedthatthere were 60 cariers，f which50cases wereissingheteroygosityinexon7andexon8ofSM1，casewasmisingheterozygosityneon8， 9casesweremising heterozygosityinexon8，and54Ocases werenotmissingexon7andexon8.Thesensitivityspecifity， accuracy rate and Kappa value of quantitative fluorescent PCR were 100.00%，100.00%，100.00% and 1 respectively. Conclusion The study confirmed that quantitative fluorescent PCR provides screning performance identical to MLPAfor SMAcarrier detectioninpregnantwomen.Withitsaditionaladvantagesofoperationaleficiencyandclinicalconvenience，quantitative fluorescent PCR emerges as a highly suitable alternative for routine screning applications in prenatal care setings. [Key words] pregnant women;spinal muscular atrophy;quantitative fluorescent polymerase chain reaction;gene

脊髓性肌萎縮癥（spinal muscularatrophy，SMA）是由運(yùn)動神經(jīng)元存活基因1（survivalmotorneuron1，SMN1）的突變或缺失引起的常染色體隱性遺傳性疾病，該疾病的特點(diǎn)為脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元變性和缺失，主要癥狀為四肢軀干和近側(cè)的進(jìn)行性、對稱性肌無力、萎縮，會降低患者的生存質(zhì)量[]由于SMA通常在兒童期發(fā)病，并且目前還沒有有效的治療方法，因此早期篩查和診斷對于預(yù)防SMA患兒的出生以及改善已患病兒童的生活質(zhì)量至關(guān)重要[2]。多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA）因其能夠在一次反應(yīng)中檢測多個基因組的靶區(qū)域，從而同時檢測多個核昔酸序列拷貝數(shù)的變化，成為了臨床上常用的SMA基因攜帶篩查方式，但MLPA多用于檢測基因的缺失和重復(fù)，對未知點(diǎn)突變的檢測能力有限，同時MLPA要求準(zhǔn)確測定DNA濃度，且樣本容易被污染，從而加大了操作難度[3-4]。而隨著醫(yī)學(xué)分子生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chainreaction，PCR）以其高靈敏性、高特異性和快速性在基因診斷領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，它可以對人血中SMN1第7、第8外顯子的純合缺失或雜合缺失進(jìn)行定性分析，能有效識別SMA基因攜帶者[5]。孕婦作為SMA基因攜帶者的篩查對象，對于預(yù)防SMA患兒的出生具有重要意義，通過對孕婦進(jìn)行SMA基因篩查，可以及早發(fā)現(xiàn)SMA基因攜帶者，從而指導(dǎo)其生育決策，減少SMA患兒的出生率[6]。基于此，本研究旨在觀察熒光定量PCR在篩查SMA基因攜帶孕婦中的效果，以期為SMA的早期篩查和預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)，并為相關(guān)政策的制定提供參考。

1資料與方法

1.1一般資料

回顧性分析來我院自行做SMA篩查的600例孕婦臨床資料，研究時區(qū)為2022年10月至2023年4月。納入標(biāo)準(zhǔn)： ① 妊娠期孕婦； ② 年齡為 23～45 歲，且病歷資料完整者； ③ 均接受熒光定量PCR技術(shù)和MLPA進(jìn)行SMA篩查； ④ 簽署知情同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn)： ① 存在SMA家族史者； ② 存在其他遺傳性疾病者； ③ 近期進(jìn)行過輸血等者； ④ 合并有嚴(yán)重的心血管疾病或惡性腫瘤者。本研究已獲得本院倫理委員會的審批（批號：KYKT2023-028）。

1.2儀器與試劑

超微量核酸蛋白測定儀，型號：Nano-600型，上海嘉鵬科技有限公司；實(shí)時熒光定量PCR儀，型號：伯樂CFX96型，上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；基因測序儀，型號：ABI350O型，美國ABI公司；全自動核酸提取純化儀，型號：DA-3200型，廣州達(dá)安基因股份有限公司。

QIAampBloodDNAMini試劑盒，貨號：51104，購自德國Qiagen公司；SMN1基因外顯子缺失檢測試劑盒，貨號：CP0101A50，上海五色石醫(yī)學(xué)科技有限公司；通用型MLPA試劑盒，貨號：BTN130832，北京百奧萊博科技有限公司；全血核酸提取純化試劑盒，貨號：DA0643，廣州達(dá)安基因股份有限公司。

1.3檢測方法

1.3.1提取DNA

采集受試者的外周靜脈血 2mL ，應(yīng)用全血基因組DNA純化試劑盒，具體方法按實(shí)際說明書操作。采用超微量核酸蛋白測定儀測定樣本DNA純度，確保吸光度 A₂₆₀/A₂₈₀ 的比值為 1.8～2.0 ，并將樣本DNA的濃度調(diào)至 20ng/μL 。

1.3.2熒光定量PCR檢測[7]

采用化學(xué)阻斷法來排除運(yùn)動神經(jīng)元存活基因2（survivalmotorneuron2，SMN2）在定性檢測中的作用，以RPP4O基因作為內(nèi)標(biāo)基因，擴(kuò)增并檢測SMN1基因第7、8外顯子（目的基因）的拷貝數(shù)，同時通過化學(xué)阻斷法來調(diào)控運(yùn)動神經(jīng)元生存活基因2的表達(dá)。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，即進(jìn)行體系配制（設(shè)置1個空白對照、1個缺失對照、3個梯度正常對照），使用實(shí)時熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增以及數(shù)據(jù)分析。分析數(shù)據(jù)時，計(jì)算各個梯度對照品E7反應(yīng)和E8反應(yīng)中目的基因和內(nèi)標(biāo)基因之間的△Ct值，ΔCt=CtFAM-CtVIC ；計(jì)算正常對照品三個梯度上E7與E8反應(yīng)的 ΔC_t 值的平均值，記為 ΔC_ta ；計(jì)算待測樣本目的基因和內(nèi)標(biāo)基因在E7、E8反應(yīng)中的ΔCt 值， ΔCt=CtFAM-CtVIC ，記為△Cts; ΔΔCt= ΔCts-ΔCta 。檢驗(yàn)結(jié)果判斷：待測樣本中，若滿足以下任意一項(xiàng)，即為SMN1基因外顯子缺失。E7反應(yīng)： ΔΔCtgt;0.8 或FAM通道無信號。E8反應(yīng)：ΔΔCtgt;1.5 或FAM通道無信號。

1.3.3MLPA分析檢測[8]

按照MLPA試劑盒的操作說明進(jìn)行操作，具體如下：取 5μL 的DNA，在 98^°C 下變性 5min ，然后降溫至 25^°C 后加入多重探針 1.5μL 和緩沖液 1.5μL ，在98^°C 下變性 1min 后在 60^°C 下雜交 18h ，將其降至54^°C 后加入Ligase-65連接酶混合物 32μL ，孵育15min 后，于 98^°C 滅活連接酶 5min ，再取連接產(chǎn)物10μL 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即 50μL：95°C 30s，60°C 30s72^°C 60s，循環(huán)35次，結(jié)束后 72^°C 延伸 20min，25^°C 保存。將擴(kuò)增產(chǎn)物 1μL 與去離子甲酰胺 9μL 和LIZ500混合，應(yīng)用測序儀檢測擴(kuò)增片段分離、峰高和峰面積，使用Genemaker分析數(shù)據(jù)，將SMN1、SMN22拷貝正常樣品作為參照，并分析每個待檢樣品的SMA相關(guān)探針比值，按照試劑盒說明計(jì)算出SMN1和SMN2基因的第7、8號外顯子拷貝數(shù)，0.45～0.70 為1拷貝； 0.70～1.30 為2拷貝； 1.30～ 1.55為3拷貝，無峰信號為片段缺失。SMN1基因拷貝數(shù)是1為SMA基因攜帶者，2為健康人群。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Genemaker以及SPSS24.0軟件分析數(shù)據(jù)。以MLPA檢測的孕婦SMA基因攜帶結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，四格表法計(jì)算PCR診斷孕婦SMA基因攜帶的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確性以及Kappa值;Kappa值大于0.6提示一致性高。

2結(jié)果

2.1MLPA分析檢測結(jié)果

600例孕婦中，攜帶者共60例，其中有50例SMN1第7號外顯子和第8號外顯子基因拷貝數(shù)均為1，9例僅SMN1第8號外顯子基因拷貝數(shù)為1，1例僅SMN1第7號外顯子基因拷貝數(shù)為1，540例SMN1第7號外顯子和第8號外顯子基因拷貝數(shù)均為2，詳細(xì)見表1。

表1MLPA分析檢測結(jié)果（例數(shù)）Table1MLPA analysis results（n）

2.2熒光定量PCR檢測孕婦SMN1基因缺失情況

統(tǒng)計(jì)得出，攜帶者共60例，其中SMN1第7、8號外顯子均雜合缺失共50例，僅第7號外顯子雜合缺失1例，僅第8號外顯子雜合缺失9例，第7、8號外顯子均未缺失共540例，詳細(xì)見圖1A、1B和表2。

注：圖A為熒光定量PCR檢測孕婦SMN1第7號外顯子雜合缺失情況，圖B為熒光定量PCR檢測孕婦SMN1第8號外顯子雜合缺失情況。

圖1熒光定量PCR檢測孕婦SMN1基因缺失情況

Fig.1Detection of SMNl gene deletion in pregnant women by quantitative fluorescent PCR

表2熒光定量PCR檢測孕婦SMN1基因缺失情況

Table 2 Detection of SMNl gene deletion in pregnant women by quantitative fluorescent PCR

2.3兩種檢測方法評估SMA基因攜帶情況的一致性分析

兩種檢測方法進(jìn)行比較，靈敏度為 100% ，特異度為 100% ，準(zhǔn)確率為 100.00% ，Kappa值為1，兩者一致性較高，見表3。

表3兩種檢測方法評估SMA基因攜帶情況的一致性分析（例數(shù)）

Table 3 Consistency analysis of two detection methods to evaluate SMA gene carrying status（n）

3討論

SMA作為一種遺傳性神經(jīng)肌肉疾病，其發(fā)病機(jī)制在于因SMN蛋白的缺乏，脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元退變，導(dǎo)致運(yùn)動神經(jīng)元的數(shù)量明顯減少，進(jìn)而引發(fā)進(jìn)行性肌無力和肌肉萎縮[9]。SMA臨床表現(xiàn)呈現(xiàn)出多樣化的特點(diǎn)，患者初期可能僅表現(xiàn)為肌肉力量的輕微下降，但隨著時間的推移，這種無力感會逐漸加重，并伴隨著肌肉體積的減少，呼吸與吞咽功能受損，受損嚴(yán)重程度直接影響到患者的生命質(zhì)量，由于疾病的快速進(jìn)展性，早期發(fā)現(xiàn)與干預(yù)對于改善患者的預(yù)后具有重要意義[10-11]。SMA 的遺傳方式為常染色體隱性遺傳，這意味著患者必須攜帶兩份SMN1基因的突變才會發(fā)病，因此對SMA的篩查與診斷尤為重要，通過對潛在基因攜帶者的檢測，能夠更為準(zhǔn)確地預(yù)測疾病的風(fēng)險(xiǎn)，并為早期干預(yù)和治療提供可能[12]。

3.1實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果情況

近年來，分子診斷技術(shù)的快速發(fā)展為SMA的篩查提供了可能，其中MLPA已成為篩查脊髓性肌萎縮癥基因攜帶孕婦的金標(biāo)準(zhǔn)，能夠同時檢測多個基因位點(diǎn)的拷貝數(shù)變化，適用于SMA等遺傳性疾病的篩查[13-14]。SMA主要由 SMN1基因的缺失或異常（突變）引起，因此篩查的重點(diǎn)在于檢測SMN1基因的狀態(tài)，而SMN2和SMN1基因的同源性高，僅存在少數(shù)堿基差異，雖然SMN2本身并不直接導(dǎo)致SMA，但它對SMA的病情發(fā)展和嚴(yán)重程度均具有重要影響[15]。實(shí)時熒光定量PCR結(jié)合了傳統(tǒng)PCR的高效擴(kuò)增能力和熒光檢測技術(shù)的實(shí)時定量特性，在PCR擴(kuò)增過程中，它能通過實(shí)時監(jiān)測與記錄熒光信號變化實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)DNA序列的精確定量，能針對SMA相關(guān)的SMN1基因特定區(qū)域（如第7、8號外顯子）設(shè)計(jì)高度特異性的引物和熒光探針，這些引物能夠精確識別SMN1基因的目標(biāo)片段[16-17]。本研究結(jié)果顯示，實(shí)時熒光定量PCR檢測出6O例攜帶者，其中SMN1第7、8號外顯子均雜合缺失共50例，僅第7號外顯子雜合缺失1例，僅第8號外顯子雜合缺失9例，第7、8號外顯子均未缺失共540例。閆有圣等[18]研究表明，在10例已知結(jié)果樣本中以第7、8號外顯子均雜合缺失為主共6例，僅第8號外顯子雜合缺失1例，第7、8號外顯子均未缺失共3例，本研究結(jié)果與之一致，進(jìn)一步說明了實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測SMN1基因狀態(tài)有效性。

3.2實(shí)時熒光定量PCR與MLPA檢測評估SMA基因攜帶情況的一致性分析

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)能夠在PCR反應(yīng)過程中實(shí)時監(jiān)測DNA的擴(kuò)增情況，并定量測定DNA的起始濃度，這種實(shí)時監(jiān)測和定量分析的能力提高了篩查的準(zhǔn)確性，有助于更準(zhǔn)確地評估孕婦攜帶SMA基因的風(fēng)險(xiǎn)，而MLPA技術(shù)雖然也能進(jìn)行定量分析，但可能需要更復(fù)雜的后續(xù)處理[19]。本研究以MLPA檢測為金標(biāo)準(zhǔn)，與MLPA技術(shù)比較，得出實(shí)時熒光定量PCR檢測的靈敏度為 100.00% ，特異度為 100.00% ，準(zhǔn)確率為 100.00% Kappa 值為1，說明兩者一致性高。分析原因可能在于實(shí)時熒光定量PCR利用熒光信號對DNA擴(kuò)增過程進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，特定的熒光探針與目標(biāo)DNA序列上的特定區(qū)域相結(jié)合能形成熒光信號，而當(dāng)探針與正確的目標(biāo)序列結(jié)合時，能產(chǎn)生熒光信號，因此該技術(shù)具有極高的特異性[20]。此外，通過對熒光信號的實(shí)時監(jiān)測，能夠準(zhǔn)確定量地測定DNA序列的濃度，從而大大提高了篩查的準(zhǔn)確性和可靠性[21]。但可能受到熒光定量PCR操作誤差、儀器靈敏度等因素的影響，仍有可能導(dǎo)致部分樣本的檢測結(jié)果有偏差，且SMN2與SMN1基因的高度同源性易導(dǎo)致在檢測過程中可能存在交叉反應(yīng)，影響結(jié)果準(zhǔn)確性，部分孕婦的SMN1基因可能存在其他類型的突變或異常，而非單純的拷貝數(shù)缺失，這些異常情況可能無法通過熒光定量PCR技術(shù)準(zhǔn)確檢測[22]。但實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的臨床操作相對簡便，僅需要抽取少量外周血作為樣本，并可在較短時間內(nèi)完成檢測，這使得篩查過程更加便捷和高效，而MLPA技術(shù)可能需要更復(fù)雜的樣本處理和實(shí)驗(yàn)操作，且檢測周期可能較長[23]。此外，實(shí)時熒光定量PCR既可以用于SMA基因攜帶者的篩查，也可以用于SMA疾病的輔助診斷[24]。這種全面性使得實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在SMA的預(yù)防和診療中具有廣泛的應(yīng)用前景。

綜上所述，實(shí)時熒光定量PCR和MLPA技術(shù)篩查SMA基因攜帶孕婦篩查效果一致，且實(shí)時熒光定量PCR具有便捷和高效等優(yōu)勢，值得臨床推廣應(yīng)用。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：趙 樂][中文編輯：牛惠;英文編輯：方 柳]