擬南芥AtCHX19基因在鹽堿脅迫應答中的功能解析

doi：10.13304/j.nykjdb.2024.0214

中圖分類號：Q786 文獻標志碼：A 文章編號：1008-0864（2025）08-0060-13

Functional Analysis of Arabidopsis thaliana AtCHX19 Gene in Response to Salt-alkali Stress

， ， ， ， ， Bowei*，SUNMingzhe* （Crop Stress Molecular Biology Laboratory，Collge of Agriculture，Heilongjiang Bayi Agriculture University， HeilongjiangDaqing ，China）

Abstract：Cation/H+exchanger（CHX）gene family participatein theregulation of plants proton and cation transport， and playan importantrolein plant growthanddevelopmentandabioticstress response.ToanalyzetheArabidopsis AtCHX genes in response to salt-alkali stress， 28AtCHX genes of Arabidopsis were analyzed.The results showed that AtCHX genes were divided into5subfamilies，and their structuresand protein sequence motifs were very conserved. Tissue expression and abiotic stress expression analysis found that AtCHXI^q expressed in roots of Arabidopsis and upregulatedbysalt-alkali stress.Furthersalt-alkali toleranceanalysisofArabidopsis mutantshowed thatthedeletionof AtCHX19 gene reduced tolerance to high saltand soda saline stress，andNa+content of mutant was significantly higherthanthatof wildtype.Aboveresults initiallyclarified thattheAtCHX19 generesponded tosaline-alkali stress byregulating Na*transport，which provided data support for further elucidating the stressresistant molecular mechanism and signaling transduction pathway mediating by CHX.

Keywords：AtCHX19；saline-alkali stress；functional analysis;CHX

植物生長發育受環境變化影響，其中土壤鹽堿化是制約植物正常生長發育的環境因素之一。我國鹽堿地總面積達9913萬 hm^2[2] ，分布于全國各地，但是不同地區的鹽分組成大不相同[]。其中，以 Na₂CO₃ 和 NaHCO₃ 構成的蘇打鹽堿土與以NaCl和 Na₂SO₄ 構成的鹽漬土相比，土壤板結、通透性不好，其碳酸氫根離子對作物造成的傷害也遠大于一般鹽漬土，而且蘇打鹽堿脅迫通常伴隨著高鹽和高 pH 混合脅迫，更加不利于植物生長5。因此，要想綜合利用鹽堿地、提高土地增量，培育耐鹽堿作物是有效的途徑之一，其關鍵在于植物耐鹽堿分子機理的研究，挖掘耐鹽堿關鍵基因。

鹽堿脅迫打破了植物細胞內外的離子平衡和pH平衡。植物吸收過多外界環境中的 Na⁺ ，將抑制其他必需陽離子的吸收，從而產生離子毒害，抑制植物的生長發育，最終導致死亡。此外，鹽堿脅迫會擾亂 pH 穩態，影響植物正常生長發育。因此，參與調控植物細胞 pH 穩態和離子平衡的陽離子質子逆向轉運蛋白（cationprotonantiporter，CPA）超家族受到持續關注。

CPA超家族是一類參與植物響應逆境脅迫的重要跨膜蛋白，包括 Na⁺/H⁺ 逆向轉運蛋白（ ΔNa⁺/H⁺ antiporter，NHX）、 K⁺/H⁺ 逆向轉運蛋白（ K⁺ effluxantiporter，KEA）和陽離子 /H⁺ 交換蛋白（ Ω（cation/H⁺ exchanger，CHX）3個亞家族[8-9]。NHX1是最早研究的 Na⁺/H⁺ 逆向轉運蛋白基因。玉米ZmNHX1響應鹽脅迫，鹽脅迫下在根部的表達量上調，同時參與 Na⁺ 和Li+轉運，維持體內離子平衡[0]。鹽脅迫條件下，藜麥 CqKEA3a 和CqKEA3b響應鹽脅迫，在幼苗中表達量上調，通過維持細胞內 K⁺ 平衡和離子穩態使植株保持正常的生長發育]。

植物CHX基因家族成員眾多，研究人員從不同植物中鑒定了CHX基因家族，才曉溪等[發現，大豆CHX基因家族可分為5個亞家族，在花中表達量較高，暗示其可能參與植物生長發育過程。賈博為等[3報道，玉米CHX可分為GroupI、GroupI和GroupV共3個亞家族，其中GroupIV受冷和鹽脅迫誘導。Sze等[4發現，擬南芥CHX基因家族分為5個亞家族，其中GroupV家族成員參與 Na⁺ 和 H⁺ 轉運，對維持擬南芥體內離子平衡發揮重要作用。AtCHX20在擬南芥保衛細胞中表達，通過調節氣孔開度，應答滲透脅迫[5];AtCHX21和AtCHX23在擬南芥花器官發育中發揮重要功能[；AtCHX23還參與體內 K⁺ 轉運，并響應鹽脅迫[1；AtCHX17和AtCHX18參與擬南芥陽離子轉運，調節 pH 穩態[18-19]。由此可見，CHX基因中的GroupV家族成員與非生物脅迫緊密相關，但對AtCHX19研究鮮有報道。

本課題組前期研究發現，GsCHX19.3定位于細胞質膜，通過增加 Na⁺ 外排或減少 Na⁺ 吸收來降低 Na⁺ 含量，從而降低離子毒害，提高過表達擬南芥的耐鹽堿性，此外， GsCHXI9.3 基因還參與調控細胞內pH穩態，能夠恢復酵母突變體在低鉀脅迫和高 pH 條件下的生長；在苜蓿中也證實了GsCHX19基因的耐鹽堿功能2。但是，關于擬南芥CHX19基因在鹽堿脅迫中的功能研究尚未見報道。

本研究對擬南芥CHX基因家族GroupIV成員的進化關系、基因結構、保守基序、氨基酸序列比對和組織表達特性進行分析，并進一步對AtCHX19在擬南芥根中表達及對響應鹽脅迫進行研究，同時利用擬南芥T-DNA插入突變體從基因沉默角度解析AtCHX19基因耐鹽堿功能，為深入研究CHX響應鹽堿脅迫應答的分子機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1植物材料

野生型擬南芥（哥倫比亞生態型，WT）由作物逆境分子生物學實驗室保存，擬南芥T-DNA插入突變體atchx19（SALK_100047C）來自擬南芥種子庫ABRC（Arabidopsis Biological Resource Center）。

1.2AtCHX19基因生物信息學分析

通過Phytozome（http：//phytozome.jgi.doe. gov/pz/portal.html）[22]在線數據庫獲得AtCHX19的核苷酸序列、編碼序列（coding sequence，CDS）、氨基酸序列等基本信息。利用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）[23]對AtCHX基因家族成員進行基因結構和保守基序分析。采用MEGA11.0中的鄰接法構建系統進化樹。從ePlant（http：//bar.utoronto.ca/eplant/）24數據庫中下載擬南芥CHX基因家族成員的組織表達數據，進一步利用TBtools軟件繪制表達熱圖。利用Clustalx1.83軟件對擬南芥CHX基因家族GroupIV成員蛋白序列進行比對，通過 SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）[25]和Uniprot（http：//www.uniprot.org）在線預測軟件分析AtCHX19蛋白可能參與的互作網絡，獲得互作蛋白的功能注釋。

1.3AtCHX19基因表達分析

1.3.1AtCHX19組織表達分析選取生長4周的野生型擬南芥，分別取子葉、莖生葉、根、花和成熟的種子，3次重復，每重復取 50mg ，采用miRcute多糖多酚植物miRNA提取分離試劑盒（天根生化科技有限公司）提取各器官總RNA，反轉錄成cDNA后進行實時熒光定量PCR擴增，以擬南芥Actin基因為內參，引物序列為Actin-S（ 5^° -TTACCCGATGGGCAAGTC-3'） 和 Actin-AS（ ??^? -GCTCATACGGTCAGCGATAC-3'）；atchx19-RT-S（ 5^′ -ACCGTTTTAGACACACTCGCCA-3'和atchx19-RT-AS（ 5^′ -GCAACATCGTTTACTCCCGCTG- ）。反應體系 15μL ，包括qRTMix 7.5μL 、正向引物 0.3μL 、反向引物 0.3μL?cDNA2μL?ddH₂O 4.9μL 。PCR程序如下： 94^°C2min;94^°C5s ， 個循環； 65^°C5s 。采用2^-ΔΔCt 法[2計算AtCHX19基因的相對表達量，檢測AtCHX19基因在不同組織中的表達水平。

1.3.2AtCHX19鹽堿脅迫表達分析將在1/2MS培養基上生長1周的野生型擬南芥移栽到培養缽中，待生長到3周齡時，對未處理的野生型擬南芥取樣，3次重復，每重復取 50mg 。然后用150mmol?L^-1 （204號 NaHCO₃ 和 150mmol?L^-1 NaCl分別進行鹽堿脅迫處理，在處理 1、3、6、12、24h 時取樣。提取總RNA，反轉錄成cDNA后進行實時熒光定量PCR，以擬南芥 Actin 基因為內參，引物序列及反應體系同1.3.1。采用 2^-ΔΔGt 法2計算AtCHX19基因的相對表達量，檢測AtCHX19基因在鹽堿脅迫下的表達水平。

1.3.3AtCHX19互作蛋白鹽脅迫表達分析將在1/2MS培養基上生長1周的野生型擬南芥和atchx19突變體移栽到培養缽中，待生長到3周齡時，用 150mmol?L^-1Na Cl進行鹽脅迫處理，以未處理的為對照，每3d處理1次，處理2次后進行取樣，每處理3次重復，每重復取樣 50mg 。提取總RNA，反轉錄成cDNA后進行實時熒光定量PCR擴增，以擬南芥Actin基因為內參，引物序列為AtNHX1-RT-S（ 5^′ -GAGCCTTCAGGGAACCACAA-3'）和AtNHX1-RT-AS（ 5^° -GTACAAAGCCACGACC-TCCA-3'）;AtNHX3-RT-S（ 5^′ -TCCGGTGTCATAAC-CGCATT-3'）和AtNHX3-RT-AS（ 5^° -ACAGCACCTC-GCATTAGACC-3’）。內參引物序列及反應體系同

1.3.1。采用 2^-ΔΔCt 法2計算AtNHX1和AtNHX3基因的相對表達量，檢測AtNHX1和AtNHX3基因在鹽脅迫中的表達水平。

1.4atchx19突變體T-DNA插入鑒定

為了鑒定擬南芥突變體是否為純合T-DNA插入突變體，在T-DNA插入序列的前后位置分別設計上下游引物，命名為P1（5'-CACTATTGATAGCC-ATAGCTGGGATC-3'）和P2（ 5^° -GAAGAACCCAAA-CAGATACAAGAGGAG-3'）；然后采用EasyPure基因組DNA提取試劑盒（北京全式金生物技術股份有限公司）提取擬南芥基因組DNA，以此為模板，利用基因特異性引物，與T-DNA載體上的固定引物（LB-anti）組合，進行 PCR 。PCR體系： 2× RapidTaqMasterMix 5μL. 、Sense primer0.2μL 、Anti-sense primer 0.2μL，gDNA 模板 2μL 、ddHO 2.6μL 。PCR程序： ： 95^°C 30s ， 60^°C 15s， 72'C40s ，30個循環； 72^°C 5min 。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，若P1+LB -anti組合能擴增出自的條帶，表明T-DNA插入；若 Pl+P2 組合不能擴增出目的條帶，說明是純合體。

提取總RNA進行反轉錄，以反轉錄的cDNA為模板，利用基因特異性引物（同1.3.1）進行PCR，PCR程序： 94^°C2min;94^°C15s，60^°C30s，72^°C 1min ，40個循環； 。PCR體系： 2× SYBR Mix 5μL， Sense primer 0.5μL Anti-senseprimer 0.5μL，cDNA 模板 1.5μL?ddH₂O2.5μL 0

1.5擬南芥atchx19突變體鹽堿脅迫耐性分析

1.5.1atchx19幼苗期鹽堿脅迫耐性分析WT和atchx19突變體種子經NaClO消毒 3min ，再用ddH₂0 清洗7～9次， 4^°C 春化處理 2d 。將滅菌后的WT和突變體種子播種在正常的1/2MS培養基上，置于培養箱培養7d；之后分別轉移至正常、含有100，115mmol?L^-1 NaCl（高鹽脅迫）及含有7、9mmol?L^-1NaHCO₃ （蘇打鹽堿脅迫）的1/2MS培養基上，垂直培養6～7d。觀察幼苗長勢，統計初生根長度并拍照。

1.5.2atchx19成苗期鹽堿脅迫耐性分析選取飽滿的WT和atchx19突變體種子，春化后播種在正常的1/2MS培養基上，培養箱培養7d后，轉移到營養缽中（營養土：蛭石 Ψ=Ψ_1：1 ），置于培養箱中培養。選取長勢一致的4周齡擬南芥進行鹽堿脅迫處理，每3d澆灌1次 150mmol?L^-1 NaHCO₃（pH9.0） 。觀察脅迫處理后植株長勢，統計存活率并拍照。

1.6atchx19成苗期 Na⁺ K⁺ 含量測定

剪取1.5.2中擬南芥植株的地上部分于105^°C 烘箱中殺青 30min ，再置于烘箱中 80^°C 烘干2d，將烘干后的樣品進行研磨，用篩子過濾掉殘渣，向篩出的粉末中加入 1mmol?L^-1 的HCl，過夜抽提，取出樣品， 11 000r?min^-1 離心30min ，采用原子吸收光譜測定法測定 Na⁺ 、 K⁺ 含量。

2 結果與分析

2.1CHX基因家族的系統發育分析

為了深入了解 AtCHX 基因，以28個擬南芥、40個大豆和16個玉米CHX氨基酸序列構建系統發育樹，結果如圖1所示。84個CHX蛋白被分為5個亞家族，其中擬南芥和大豆CHX蛋白可分為5組，而玉米CHX蛋白只有3組（GroupI、Group I和GroupIV）。這一結果表明，GroupI亞家族和GroupV亞家族是大豆和擬南芥等雙子葉植物所特有的，而Group I、Group I和Group IV可能是植物生長發育所必需的。

2.2擬南芥CHX基因家族的序列和結構域分析

對AtCHX基因結構進行分析，結果（圖2）表明，28個擬南芥CHX基因都含有內含子和外顯子，其中內含子數量為1～4個。在各組內，基因結構分布相似。其中，GroupV基因的內含子序列最長，且大多數基因都有 5^° -UTR區和 -UTR區。在28個AtCHX基因中，有3個只有 -UTR區，有8個沒有UTR區。

進一步對蛋白的保守結構域和保守基序進行分析，結果（圖3）表明，N端的motif2、motif6、motif9、motif10、motif11、motif14和motif15共同構成了 Na⁺/H⁺ exchanger結構域，在此結構域的C端緊鄰1個AANH-like結構域，由motif1、motif3、motif4、motif7、motif8構成。此外，在擬南芥CHX蛋白的C端還包含保守的motif5、motif12和motif13，但它們的功能還未知。綜上表明，各組內AtCHX基因在基因結構和保守結構域的分布上均較保守。

Fig.2 Gene structure of CHX gene on Arabidopsis thaliana

圖2擬南芥CHX基因結構

圖3擬南芥CHX蛋白的保守結構域和基序

Fig.3Conserved domainand motif of CHX proteins in Arabidopsis thaliana

2.3擬南芥CHX基因家族GroupIV蛋白序列分析

由于 AtCHX 基因在花中表達量較高，且GroupIV中基因的表達水平相對較高，其余4組中基因的表達水平非常低[4]，因此對GroupIV中的基因進行蛋白序列比對，如圖4所示。多重序列比對發現，GroupIV成員的蛋白序列相似度較高，且在N端都含有1個保守的 Na⁺/H⁺ exchanger結構域，說明GroupIV成員在基因功能上具有一定的相似性。

圖4擬南芥CHX家族GroupV成員的蛋白序列比對Fig.4Sequence comparison of CHX proteins of Group IV in Arabidopsis thaliana

Note：Theredline identifies the Na⁺/H⁺ exchanger conserved domain position.

2.4擬南芥 CHX 基因家族GroupIV成員組織表達模式分析

為研究擬南芥CHX家族GroupIV成員基因功能，基于ePlant數據庫分析AtCHX基因的組織表達特性，結果如圖5所示。GroupV中大部分成員在花和種子中高表達，暗示AtCHX基因在擬南芥生殖生長中發揮重要作用。其中，AtCHX15和AtCHX16優先在花粉中表達，在擬南芥種子繁殖和發育中起重要作用；AtCHX21和AtCHX23在擬南芥花器官發育中具有重要功能；AtCHX19在花粉管中表達，花粉管受損會影響其生育能力，進而影響擬南芥生長發育]。除了在花中高表達外，GroupIV中的成員在其他組織中也有不同程度的表達。其中，AtCHX23參與體內 K⁺ 轉運，并響應鹽脅迫;AtCHX20在擬南芥保衛細胞中表達，通過調節氣孔開度，應答滲透脅迫[15；AtCHX17和AtCHX18參與擬南芥陽離子轉運，調節 pH 穩態[18-19]，當高鹽脅迫來臨時，AtCHX17表達量增高，維持擬南芥體內離子穩態2]。綜上所述，GroupIV家族成員與擬南芥生長發育和非生物脅迫響應緊密相關。

Fig.5Tissue expression pattern of CHX geneofGroupNinArabidopsis thaliana

2.5擬南芥CHX19組織表達模式驗證

由圖6可知，AtCHX19基因的表達量與ePlant數據庫結果一致，其在花和種子中的表達量最高，對擬南芥生殖生長起重要作用；此外，與子葉和莖生葉相比，AtCHX19在根中的表達也相對較高，可能參與擬南芥根際離子轉運。

2.6擬南芥CHX19鹽堿脅迫表達模式分析

為揭示AtCHX19在鹽堿脅迫應答中的作用，對AtCHX19在 150mmol?L^-1 NaHCO和 150mmol^-1 NaCl脅迫處理下表達模式進行分析，結果如圖7所示。在 150mmol?L^-1NaHCO₃? 處理下，隨著脅迫時間的延長，AtCHX19基因的表達量呈先升后降的變化趨勢，在脅迫 3h 時，AtCHX19基因的表達量最高，說明AtCHX19基因能響應蘇打鹽堿脅迫。在150mmol ?L^-1NaCl 處理下，AtCHX19基因的表達量變化不明顯，與在線轉錄組分析結果基本一致。綜上表明，AtCHX19基因受蘇打鹽堿脅迫誘導表達。

2.7AtCHX19轉基因擬南芥T-DNA插入突變體鑒定及分子生物學檢測

對突變體atchx19進行分子鑒定表明，T-DNA插入在AtCHX19基因的第2個外顯子區（圖8A）。采用“三引物法\"經過2次PCR反應證實，突變體為T-DNA插入（圖8B）且已純合（圖8C）。進一步檢測AtCHX19基因在atchx19突變體中的轉錄水平，結果如圖8D所示，在突變體中沒有檢測到AtCHX19基因的表達，因此將T-DNA插入的純合突變體atchx19用于后續耐鹽堿性分析。

圖5擬南芥CHX基因GroupIV中成員的組織表達模式

圖6AtCHX19基因在擬南芥不同器官中的表達Fig.6Expression of AtCHX19 gene in different organsofArabidopsisthaliana

注：**表示在 Plt;0.01 水平顯著。 Note：**indicates significant at Plt;0.01 level.

注：*表示與0h相比在 Plt;0.05 水平差異顯著。

Note： * indicates significant difference compared with the expression of O h at Plt;0.05 level.

Fig.7Quantitative real-timePCR analysis of expression of AtCHX19 gene under different stresstreatmetns

圖8AtCHX19轉基因擬南芥T-DNA插入突變體鑒定

Fig.8Identification of T-DNA insertion mutants of AtCHX19 transgenic Arabidopsis thaliana

A：T-DNA插入突變體SALK_10047C;B：AtCHX19基因敲除突變體T-DNA插入鑒定;C：AtCHX19基因敲除突變體純合鑒定;D：RT-PCR 鑒定atchx19突變體。M—Trans2KPlusIIDNAMarker;-—陰性對照; + 一陽性對照;1～8—擬南芥突變體 A：T-DNwasinsertedintothemutantSALK_1o47C；B：PCRidentificationofAtCHX19siliencinginsertion；C：PCRidentificationof AtCHX19sliencinghomozous；D：Identificationofatchx19mutantsbyR-CR.M—Trans2KPlusIDNAMarker；—Negativecotrol; +——Positive control;1～8—Arabidopsis mutants

2.8擬南芥CHX19互作蛋白功能解析及鹽脅迫表達模式分析

為解析AtCHX19基因耐鹽堿功能，利用SMART分析AtCHX19可能參與的信號傳導通路，結果（表1）表明，AtCHX19蛋白與 Na⁺/H⁺ 逆向轉運蛋白NHX1、NHX3存在相互作用。NHX1、NHX3為Na+/H逆向轉運蛋白參與植物體內的離子轉運，同時也參與響應非生物脅迫。AtNHX1在擬南芥細胞內Na+穩態中起重要作用，AtNHX1通過向外運輸 Na⁺ 來阻止胞質內 Na⁺ 的積累，減少Na+在莖部和根部的積累，進一步減輕鹽脅迫的損害[2]。AtNHX3在甜菜中過表達可維持 K⁺ 穩態，從而提高植株的耐鹽性30。對AtCHX19互作蛋白功能進行注釋發現，互作蛋白與離子轉運相關，且響應鹽脅迫，推測AtCHX19可能與其互作蛋白功能相似，存在于同一條信號通路上。

綜上所述，AtCHX19互作蛋白AtNHX1和AtNHX3均響應鹽脅迫，所以進一步利用實時熒光定量PCR分析AtCHX19互作蛋白基因AtNHX1和AtNHX3在鹽脅迫中的表達，如圖9所示。在150mmol?L^-1 NaCl處理下，AtNHX1和AtNHX3在WT、atchx19突變體中的表達量均顯著高于脅迫處理前，且脅迫處理后WT和atchx19突變體相比無顯著變化，因此推斷AtCHX19與AtNHX1和AtNHX3的互作可能不是通過轉錄水平響應鹽脅迫，而是在蛋白翻譯水平響應鹽脅迫。

表1AtCHX19互作蛋白功能注釋

Table1 Functional annotation of AtCHX19 interacting protein：

注：**表示與 0mmol?L^-1 NaCl處理在 Plt;0.01 水平差異顯著。

Note： ^** indicates significant difference with Ommol L^-1 NaCl treatment at Plt;0.01 level.

圖9 150mmol?L^-1 NaCl處理下AtNHX1和AtNHX3基因的表達

Fig.9Expression of AtNHX1 and AtNHX3 genes under 150mmol L^-1 NaCl treatment

2.9AtCHX19基因敲除降低擬南芥耐鹽堿性

對atchx19突變體進行耐鹽堿性分析，結果如圖10所示。在正常條件下，WT和atchx19均能正常生長，狀態一致且根長也基本一致；而在NaCl脅迫處理下，所有植株的地上部生長均出現異常，且根系生長受到抑制，尤其是在 115mmol?L^-1 NaCl處理下， atchxl9 突變體的根長明顯短于WT，表明AtCHX19基因敲除降低了植物對高鹽脅迫的耐受性；在 NaHCO₃ 脅迫處理下，所有植株的根系生長都受到抑制，尤其是 ）mmol?L^-1 NaHCO處理后，atchx19突變體的根長僅 2.94cm ，說明AtCHX19基因的敲除降低了植物對堿脅迫的耐受性。

進一步對atchx19突變體和WT的植株進行150mmol?L^{-1 -1}NaHCO₃ 處理，結果如圖11所示。脅迫處理15d時，植株表現為失綠、葉片萎蔫，甚至死亡。與WT相比， atchxl9 突變體的存活率更低，說明AtCHX19基因的敲除降低了植物對鹽堿脅迫的耐受性。

2.10AtCHX19基因敲除導致擬南芥 離子平衡紊亂

進一步測定擬南芥突變體atchx19和WT在鹽堿脅迫處理前后地上部的 Na⁺，K⁺ 含量，結果如圖12所示。在正常生長情況下，突變體atchx19的 Na⁺ 含量顯著高于WT，而 K⁺ 含量略低于WT，表明在正常條件下AtCHX19基因的敲除降低了植物對Na+的外排作用。在 150mmolL^-1NaHCO₃ 處理15d時，植株地上部 K⁺ 含量下降， Na⁺ 含量升高，且突變體atchx19的 Na⁺"含量顯著高于WT。在正常條件下，突變體atchx19的 K⁺/Na⁺"值顯著低于WT；在鹽堿脅迫處理后，植株的 K⁺/Na⁺"值較正常條件顯著下降，且突變體atchx19的 K⁺/Na⁺"值極顯著低于WT。由此表明，AtCHX19基因的敲除顯著降低了突變體atchx19對Na+的外排，導致細胞內離子平衡失調。

A：不同NaCl水平下幼苗表型;B：不同NaHCO3水平下幼苗表型;C：不同NaCl水平下幼苗根長;D：不同 NaHCO₃ 水平下幼苗根長。*表示與野生型間在 Plt;0.05 水平差異顯著

圖10野生型和 atchxl9 突變體在不同鹽堿脅迫下幼苗期的表型

A：Phenotype of seedlingunderNaCl treatment；B：Phenotype of seedlingunder NaHCO₃ treatment；C：Root length of seedlingunder NaCl treatment；D：Rootlengthof seedlingunder NaHCO₃ treatment.*indicatessignificantdifferencecomparedwithWTat Plt;0.05 level

A：表型；B：存活率；*表示突變體與野生型間在 Plt;0.05 水平差異顯著。

Fig.10Phenotypy of WTand mutant atchx19 at young seedlings stage under saline-alkali stress

圖11不同鹽堿脅迫下野生型和突變體atchx19在成苗期的表型

Fig.11Phenotypicof WTand mutant atchx19at seedling stage under saline-alkali stress

：Phenotype；B：Survival rate；*indicates significantdifferencebetweenmuntant and WTat Plt;0.05 level.

A：不同處理下的 K⁺ 含量;B：不同處理下的 Na⁺ 含量： c：atchxI9 突變體在 NaHCO₃ 處理前的 K⁺/Na⁺ ;D：atchx19突變體在NaHCO3處理后的K+/Na+。*和**分別表示與野生型間在 Plt;0.05 和 Plt;0.01 水平差異顯著A： K⁺ content under different treatments；B： Na⁺ content under different treatments；C： K⁺/Na⁺ under control treatment；D： K⁺/Na⁺ underNaHCO₃ treatment. * and ** indicate significant differences ampared with WTat Plt;0.05 and Plt;0.01 levels，respectively

圖12不同處理下野生型和突變體 atchxI9 的 Na⁺ K⁺ 含量

Fig.12 Contentsof Na⁺ = K⁺ inWTand mutantatchx19underdifferent treatments

3討論

本研究利用生物信息學方法，對28個AtCHX基因家族成員進行系統發育分析將其劃分為5個類群。通過MEME軟件分析發現， AtCHX 基因序列高度保守，都含有Na+/Hexchanger結構域，在C端緊鄰1個AANH-like結構域，且C端還有1個非常保守的結構域。研究表明，C端結構域可以幫助AtCHX17蛋白正確定位于細胞內膜上[31]，由此推測，AtCHX蛋白的C端結構域可能與其蛋白正確定位有關。對擬南芥CHX基因家族GroupV的成員進行比對發現，組內成員的基因結構、保守基序及功能具有相似性。組織表達模式熱圖和實時熒光定量PCR分析發現，AtCHX19在擬南芥的根中表達并響應鹽脅迫，利用SMART預測了AtCHX19的互作蛋白，推測AtCHX19在鹽脅迫下對植物體內 Na⁺，K⁺ ） NH₄⁺ 等陽離子的轉運起至關重要作用。

本研究發現， AtCHXI9 基因的敲除降低了突變體atchx19幼苗期和成苗期對鹽堿脅迫的耐受性，且突變體atchx19在鹽堿脅迫下地上部的 Na⁺ 含量急劇上升， Na⁺/K^? 增大。這一結果與AtCHX19的野生大豆同源基因GsCHX19.3基因的功能類似[20]。CHX參與高鹽、滲透、低鉀脅迫響應。研究表明，在 GmCHXI 啟動子區域存在1個脅迫響應元件，可提高大豆的耐鹽性，在鹽脅迫條件下維持大豆的產量，減少損失[32]。AtCHX13與植物體內K⁺ 攝取密切相關[33]； AtCHXI4 參與調節 K⁺ 平衡及K⁺ 循環利用[34]；AtCHX17受高鹽和低鉀脅迫誘導并平衡 K⁺ 穩態[35]； AtCHX2I 和AtCHX23在雌配子體發育過程中維持細胞內 K⁺ 平衡，且AtCHX23對維持葉綠體 pH 穩態和植物 K⁺ 吸收起關鍵作用[36]。綜上所述，CHX基因在響應逆境脅迫時發揮重要作用，且AtCHX19基因的敲除降低了突變體的耐鹽堿性，為深入研究CHX19參與蘇打鹽堿脅迫應答的作用機理奠定了基礎。后續可通過酵母雙雜交、雙分子熒光互補、螢火素酶互補等試驗進一步研究AtCHX19與相關蛋白的相互作用，為深入揭示AtCHX19耐蘇打鹽堿分子機制及信號傳導通路提供理論依據。

參考文獻

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