一株拮抗葡萄灰霉病菌的貝萊斯芽孢桿菌篩選及鑒定

doi：10.13304/j.nykjdb.2024.0386

中圖分類號：S182 文獻標志碼：A 文章編號：1008-0864（2025）08-0110-09

Screeningand Identificationofa Strain of Bacillusvelezensis AgainstBotrytiscinerea

LIHaiyan ¹ ，ZHANGTing1，LIXinchang1，ZHANGLing1，WANGPei2，BAOMinhu1* （1.ChengdeAcademyofAgriculturalandForestrySciences，HebeiChengdeO67ooo，China;2.NationalAgro-techExtensionad Service Center，Beijing100125，China）

Abstract：InordertoisolateabiocontrolbacteriawithantagonsticfetsonBotrtiscinerea，theantagonisticbacteriaere screned from graperhizosphere soilsbyplateconfrontation methodandliter paper method.Astrain with strong antagonistic efectwasselectedandidentifiedbymorpholoigical，physiologicalandbiochemicalcharacteristics，16SrDNAsequences analysis.Thesafety，growth-promotingand thecontrol efectof thestrain were testedbytheblood platemethod，seed germination experimentsanddetached fruitmethod.Theresultsshowedthat5antagonisticbacteriawerescreened from142 bacterialstrainsisolatedfromgraperhizospheresoils.These5antagonisticbacteriahaddiferentinhibitoryefectongrape gray mold disease with the inhibition rates from 81.74% to 89.13% ，and the inhibition zone were from 2.42 to 11.08 mm， amongwhichtheinhibitoryeffectof strainB1-4wasthehighest.Bymorph-oloigical，physiologicalandbiochemical characteristics，16SrDNA sequences，strain B1-4 was identifiedasBacilusvelezensis，which hadno hemolysis，could producecelulase，proteaseand siderophores，and hadnitrogen fixation efect.Thegerminationrateandradiclelengthof cucumberandrapeseed seedscould besignificantly improved by10O times dilutionofB1-4fermentationsolution.The protective effect of B1-4 fermentation liquid reached 70.31% and the rapeutic effect was 69.53% on postharvest grape fruit gray mold，which was no significant diference with 5 OoO times dilution of 50% fludioxonil （ 71.88% ）.Above results showed thatB. velezensis B1-4 was a protential biocontrol strain for control B. cinerea.

KeyWords：Bacilusvelezensis；Botrytiscinerea；isolationandidentification；growthpromotion；antagonisticeffect

灰霉病是對葡萄生產具有重要影響的病害之一，病原菌為灰葡萄孢（BotrytiscinereaPers.）]，該菌可侵染葡萄的葉片、花穗、果穗和穗軸等，破壞植物組織正常生長，嚴重影響葡萄品質和產量[2]。發生灰霉病可造成葡萄減產，有的葡萄園病穗率可達 40% 以上；發病嚴重時，有的品種甚至造成絕收3。葡萄灰霉病的防治仍以化學農藥為主，由于灰葡萄孢生理小種變異頻繁，生產上農戶通過加大施藥量和增加施藥次數進行防治。隨著藥劑高頻率使用，病原菌已產生不同程度的抗藥性[45]，殘留的農藥不僅危害人類健康，還會破壞土壤微生態平衡。

生物防治具有安全無污染、無抗藥性等特點，是植物病害綠色防治的重要措施。芽孢桿菌可以產生抑菌活性物質，并且可促進植物生長，在農業領域發揮著越來越重要的作用，因此，芽孢桿菌屬（Bacillus）被認為是一種很有前途的生物防治菌。貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）是好氧細菌，是芽孢桿菌屬的一種，Ruiz-Garcia等于2005年在西班牙南部馬赫拉加省貝萊斯河口的土樣中首次分離得到。貝萊斯芽孢桿菌能夠分泌多種拮抗植物病原菌的活性物質來發揮生防作用，如抗菌脂肽、胞外酶和促生類物質。李坤璃等研究表明，貝萊斯芽孢桿菌5-8能產生抑制稻瘟病菌（Pyriculariaoryzae）孢子萌發的豐原素和伊枯草菌素；冉新炎等篩選的貝萊斯芽孢桿菌K-19可產生表面活性素，有效抑制灰葡萄孢和根腐病病原菌生長；曾欣等[篩選到貝萊斯芽孢桿菌B-11，其發酵液對鐵皮石斛炭疽病（Colletorichumgloeosporioides）的防治效果可達 64% 。

隨著我國對綠色農業發展要求的提高，挖掘不同生境下具有生防作用的微生物資源用于生物防治具有重大意義。本研究擬從健康葡萄根際土中分離對灰霉病菌具有較強拮抗作用的貝萊斯芽孢桿菌，并分析菌株的胞外酶活性、促生性、抑菌作用和離體防效，以期為生防菌劑開發和灰霉病防治提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試土樣采自科研基地5年葡萄種植園。供試病原菌為葡萄灰霉病病菌灰葡萄孢（B.cinerea），菌株編號HM22-5，由農業生態研究所分離、鑒定和保存。供試農藥為 50% 咯菌腈可濕性粉劑，購自先正達（蘇州）作物保護有限公司。

供試培養基如下。PDA培養基：馬鈴薯200g ，葡萄糖 20g ，瓊脂粉 20g ，蒸餾水1L；NB培養基：蛋白脈 10g ，牛肉浸粉 3g，NaCl5g ，瓊脂粉 17g ，蒸餾水 1L，pH 7.0～7.4 。NB液體培養基：蛋白脈 10g ，牛肉浸粉 3g，NaCl5g ，蒸餾水1L，pH7.0～7.4 。羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulosesodium，CMC）培養基：胰蛋白脈 10g ，酵母浸粉 5g，NaCl10g ，羧甲基纖維素鈉 10g ，瓊脂15g ，蒸餾水 1L，pH6.0 。酪蛋白培養基：酪蛋白10g ，牛肉浸粉 3g NaCl5g，NaH₂PO₄2g ，瓊脂粉15g ，溴麝香草酚藍 0.05g，pH7.3-7.5 。無氮培養基：甘露醇 10g，K₂HPO₄ 0.2g，CaSO₄?2H₂O 0.2g CaCO₃5g，NaCl 0.2g，MgSO₄?7H₂O 0.2g ，瓊脂粉20g ，蒸餾水 。產鐵載體培養基：CAS（chromeazurol S） 60.5mg ，十六烷基三甲基溴化銨72.9mg ， FeCl₃?6H₂O 2.645mg ， NaH₂PO₄?2H₂O 295.25mg ， Na₂HPO₄?12H₂O 1 213.5mg NH₄Cl 125mg，KH₂PO₄37.5mg，NaCl 62.5mg 。

1.2拮抗細菌的篩選

1.2.1拮抗細菌的初篩參考周明國方法，稱取 10g 土壤樣品置于含 90mL 無菌水和10顆直徑6mm 滅菌玻璃珠的 250mL 三角瓶中，搖勻后放在搖床 振蕩 30min ；土壤懸浮液靜置后吸取上清液 1mL 加入到含有 9mL 無菌水的50mL 滅菌可立離心管中，混勻后即得 10^-1 稀釋液，依次將土壤懸浮液稀釋至 10^-5 備用。分別從 10^-3 、10^-4，10^-5 土壤懸浮液樣品中吸取 200μL 涂布于NB平板培養基上，3次重復， 培養箱內培養。挑取單菌落與菌株HM22-5進行對峙培養，篩選出具有抑菌作用的菌落，保存。

1.2.2拮抗細菌的復篩參考周泠璇等2方法，分別把初篩得到的拮抗細菌制備成為 10⁶CFU?mL^-1 菌懸液，將培養好的菌株HM22-5用直徑為 8mm 打孔器打取菌餅，接種在PDA平板中間；在距離平板中心 2.5cm 處的4個角點上放上直徑為 6mm 無菌濾紙片，每個濾紙片加 20μL 拮抗細菌菌懸液，每供試菌株設3次重復。 恒溫培養，4d后測量抑菌圈大小，并計算抑制率。

抑菌率 = 對照菌落直徑-處理菌落直徑）（對 照菌落直徑-菌餅直徑 ）×100% （1

選擇拮抗作用較強菌株，將其命名為B1-4，進行后續試驗。

1.3拮抗細菌B1-4的鑒定

1.3.1形態學鑒定和生理生化特性研究將菌株B1-4接種在NB培養基平板，在培養箱中 恒溫培養 24h ，觀察單菌落形態特征；對菌株進行革蘭氏染色，通過觀察菌體、芽孢顏色和形態進行初步鑒定。依據《常見細菌系統鑒定手冊》3進行生理生化特性研究。

1.3.2分子鑒定使用細菌基因組DNA提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]提取菌株B1-4基因組DNA后，使用通用引物27F（ ?5^′ -AGT-TTGATCMTGGCTCAG-3'）/1492R（ [5^′ -GGTTACCT-TGTTACGACTT-3'）進行PCR，PCR體系 25μL PCR程序： 90s，30 個循環； 。PCR擴增產物經1.5% 瓊脂糖凝膠檢測合格后，用DNA膠回收試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]回收自標片段與TaKara pMD^*18 -TVerctor連接，篩選陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序得到的核酸序列通過GenBank數據庫Blast進行序列比對，搜索下載其同屬近緣菌種的16SrDNA序列，構建系統發育樹。

1.4拮抗細菌B1-4生長曲線的測定

參照歐陽曉倫等[14方法，拮抗菌B1-4在NB平板培養基上劃線， 25°C 培養 24h 后，將單菌落接種于NB液體培養基中，置于搖床培養 24h （25^°C，120r?min^-1） ，得到菌株B1-4種子液。移液槍吸取B1-4種子液 2mL ，接種在 500mL 三角瓶中，每瓶裝NB液體培養基 200mL ，置于恒溫搖床 培養，3次重復；每 ^4h 取樣1次，利用分光光度計測定其 0D₆₀₀ 值，以測定時間為橫坐標，以 0D₆₀₀ 值為縱坐標繪制生長曲線。

1.5拮抗細菌B1-4發酵液的制備

挑取培養好的拮抗菌株，轉接至 250mL 三角瓶中，每瓶裝 100mL NB液體培養基，培養溫度25^°C 轉速 120r?min^-1 ，振蕩培養 24h 得到種子液。吸取 2mL 種子液至三角瓶中，每瓶裝 200mL NB液體培養基，振蕩培養（ 25^°C，120r?min^-1）48h 得到發酵液。將上述發酵液 4^°C，10000r^?min^-1 離心2min ，上清液轉移至無菌離心管中，經 0.22μm 微孔濾膜（水系）進行過濾，得到無菌發酵液，置于4^°C 冰箱保存備用。

1.6拮抗細菌B1-4胞外酶活性測定

1.6.1纖維素酶活性檢測將菌株B1-4接種在羧甲基纖維素鈉檢測培養基上，于培養箱內 培養3d，用 1g?L^-1 剛果紅溶液倒入培養皿浸泡30min ，再用 1mol?L^-1NaCl 溶液清洗，如果菌落周圍出現透明圈，表明該菌株具有纖維素酶活性[15]。1.6.2蛋白酶活性檢測挑取拮抗菌株B1-4單菌落接種在酪蛋白培養基上，于培養箱內 培養3d，如果菌落周圍出現透明圈，則表明該菌株具有蛋白酶活性[5]。

1.7 拮抗細菌B1-4促生性測定

1.7.1固氮能力檢測將菌株B1-4單菌落接種在無氮培養基上，于培養箱內 培養3d，若菌株可在無氮培養基生長，則表明該菌株具有固氮能力[6]。1.7.2產鐵載體能力檢測用接種針挑取培養好的B1-4菌株，接種于CAS培養基平板上，于培養箱內 培養2d，觀察菌落周邊顏色變化;如果產生透明圈，則表明該菌株具有產鐵載體的能力[6]。

1.8拮抗細菌B1-4對種子萌發的影響

分別將小油菜種子和黃瓜種子放在直徑為15cm 的無菌培養皿內，依次用 75% 乙醇浸泡1min，0.1% 升汞浸泡 3min 進行表面消毒、滅菌水清洗5次后，用滅菌濾紙將種子表面水分吸干轉移至鋪有2層無菌濾紙的 15cm 培養皿中。分別用1.5中制備的B1-4發酵液（B1-4）及其 50（B）-4₅₀， ）、100（B1-4₁₀₀） 和200倍稀釋液 Bl-4₂₀₀ ），浸泡小油菜和黃瓜種子，以等量無菌水浸泡種子為對照（CK1處理），另將小油菜種子和黃瓜種子置于NB液體培養基（NB處理）培養。每培養皿50粒種子，每處理3次重復，放置 25°C 、光照 14h 黑暗10h培養箱中培養 10h，3d 后調查種子萌發率，隨機選取5棵萌發種子測其胚根長[17-18]。

1.9拮抗細菌B1-4對葡萄灰霉病離體防效檢測

挑選大小、成熟度一致的紅提葡萄，自來水清洗干凈后，用 1% 次氯酸鈉溶液消毒30s，無菌水清洗3次。試驗設2個處理： ① 保護作用，葡萄果粒分別噴施 1×10⁸ CFU·mL^-1 的B1-4發酵原液（PB1-4）及其 50（PB1-4₅₀ ） $＼ 、 1 0 0 ＼bigl （ ＼mathrm { P B } 1 { - } 4 _ { 1 0 0 } ＼bigr ）$ 和200倍稀釋液（ PB1-4₂₀₀ ）， 24h 后刺傷果皮接種直徑為8mm 灰霉病菌菌餅； ② 治療作用，刺傷葡萄粒果皮后接種直徑為 8mm 的灰霉病菌餅， 24h 后分別噴施 1×10⁸CFU?mL^-1 的B1-4發酵原液（CB1-4）及其50（ CB1-4₅₀ ）、 .100（CB1-4₁₀₀） 和200倍稀釋液（ CB1-4₁₀₀， ，以噴施無菌水作為空白對照（CK2），噴施咯菌腈 WP5000× 液作為藥劑對照（CK3）。每個處理10個果粒，3次重復。在 25°C 條件下培養5d，觀察統計果面發病情況，計算葡萄灰霉病病情指數和防效[9]，葡萄灰霉病的分級標準如表1所示。

防效 °leddash 對照病情指數－處理病情指數 ×100% 對照病情指數

2 結果與分析

2.1拮抗細菌的篩選

從葡萄根際土壤中共分離出142株細菌，初篩得到5株具有拮抗作用的細菌（表2）；對5株拮抗細菌進行復篩，結果（圖1）顯示，5株均具有明顯的抑菌帶，抑菌帶在 2.42～11.08mm ，其中B1-4抑菌效果最好，抑菌帶為 11.08mm ，顯著大于其他菌株。由表2可知，5株拮抗細菌的抑菌率均大于 80% ，其中，菌株B1-4抑菌率最高，為 89.13% ，與菌株0-1差異不顯著，但顯著高于其他菌株。因此，選擇菌株B1-4進行后續分析。

表1葡萄灰霉病分級標準

Table1 Grading standard of grape gray mold disease

表25株拮抗細菌對灰葡萄孢的抑菌效果

Table2Inhibitory effectsof5antagonisticbacteria against Botrytis cinerea

注：同列不同小寫字母表示不同菌株間在 Plt;0.05 水平差異顯著。Note：Different letters in same column indicate significantdifferencesbetween different strains at Plt;0.05 level.

圖1拮抗細菌篩選

Fig.1Screening of antagonistic bacteria

2.2 拮抗細菌B1-4的鑒定

2.2.1形態特征、革蘭氏染色及生理生化特性研究由圖2可知，菌株B1-4在NB平板上，菌落顏色為乳白色，生長一段時間后，菌落中心呈現凹陷狀（圖2A）；對菌株進行革蘭氏染色呈紫色，為革蘭氏陽性菌，菌體呈桿狀（圖2B）；檸檬酸鹽試驗、V-P試驗、丙酸鹽試驗、硝酸鹽還原反應和明膠液化結果為陽性；淀粉水解反應不變藍；接觸酶反應有氣泡產生；可利用D-甘露醇碳源，不可利用D-木糖和L-阿拉伯糖； 7% NaCl環境可生長； pH5.7 可生長。

圖2B1-4的菌落形態及革蘭氏染色（ ×100 一 Fig.2Colony morphology and gram staining of B1-4（ ×100

因此，結合菌落特征、革蘭氏染色和生理生化特性，將菌株B1-4初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。2.2.2分子生物學鑒定結果對菌株B1-4測序表明，16SrDNA序列全長 1486bp ，將其在NCBI數據庫比對，判斷菌株B1-4為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvenezensis）；由系統發育樹（圖3）可知，B1-4與貝萊斯芽孢桿菌CP12855.1同屬1個分支，序列一致性為 99% 。因此，結合菌落形態特征和革蘭氏染色結果，最終將菌株B1-4鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

2.3拮抗細菌B1-4生長曲線測定

由圖4可知， 0～12h ，菌株B1-4的OD值增長緩慢，為延緩期； 12～44h ，OD值增長較快，為對數期； 44～72h ，OD值基本不變，為平穩期； 72h 后，OD值開始下降，為衰亡期。

圖3菌株B1-4及相關菌株的系統發育樹

Fig.3Phylogenetic tree ofB1-4and itsrelated strains

圖4菌株B1-4的生長曲線Fig.4Growth curve of strain B1-4

2.4拮抗細菌B1-4胞外酶活性和促生性分析

由圖5可知，菌株B1-4在羧甲基纖維素鈉（CMC）培養基和酪蛋白培養基產生黃色和白色透明圈，表明該菌株具有纖維素酶活性和蛋白酶活性；在無氮培養基上，菌落長勢較好，說明菌株B1-4具有固氮能力；在CAS培養基上，菌落周圍出現白色透明圈，說明菌株B1-4可以產生鐵載體。

2.5拮抗細菌B1-4對種子萌發的影響

由表3可知，菌株B1-4的發酵液影響黃瓜和小油菜種子萌發和胚根長度。當使用發酵原液（B1-4處理）浸種時，黃瓜和小油菜種子萌發被完全抑制；使用發酵液的50倍稀釋液（ B1-4₅₀ 處理）浸種時，黃瓜和小油菜種子的萌發率和胚根長度顯著低于無菌水對照（CK1），表明發酵液的50倍稀釋液對黃瓜和小油菜種子的萌發、胚根長度具有顯著抑制作用。使用發酵液的100倍稀釋液C B1-4₁₀₀ 處理）浸種，黃瓜和小油菜種子萌發率、胚根長度顯著高于無菌水對照，說明發酵液的100倍稀釋液對黃瓜和小油菜種子萌發率、胚根長度具有顯著促進作用。使用發酵液的200倍稀釋液0 B1_-4₂₀₀ 處理）和NB液體培養基，對黃瓜和小油菜種子的萌發率、胚根長度無顯著影響。

圖5不同培養基上菌株B1-4的生長

Fig.5 Growth of strain B1-4 under different culture mediums

表3不同B1-4發酵液處理下黃瓜、小油菜種子的萌發

Table 3Germination of cucumber and rape seeds treated with diferent B1-4 fermentation broth treatments

注：同列不同小寫字母表示不同處理間在 Plt;0.05 水平差異顯著。 Note：Different lowercaseletters in samecolumn indicate significantdiffrences betweendiffrenttreatmentsat Plt;0.05 level.

2.6拮抗細菌B1-4的離體防效

由表4可知，各處理的病情指數均顯著低于對照（CK2）的病情指數，表明B1-4和 50% 咯菌腈WP的5000倍稀釋液（CK3）均對葡萄灰霉病有較好的防治作用。保護作用中發酵原液的防效最高，與發酵液的50倍稀釋液間差異不顯著，但顯著高于其他稀釋液處理；治療作用中發酵原液的防效顯著高于其他稀釋液處理，且不同稀釋液間均差異顯著。B1-4發酵原液在保護作用和治療作用的防效分別為 70.31% 和 69.53% ，與CK3處理差異不顯著。

3討論

本研究從健康葡萄根際土壤中分離出5株具有拮抗作用的細菌，對灰霉病菌的抑菌率均在80% 以上，其中菌株B1-4對葡萄灰霉病菌的拮抗作用最強。對該菌株進行形態學和分子生物學鑒定，結果表明，B1-4為貝萊斯芽孢桿菌；對其生防效果進行初步測定，該菌株發酵原液對葡萄灰霉病的保護作用離體防效為 70.31% ，治療作用離體防效為 69.53% ，與 50% 咯菌腈5000倍稀釋液離體防效 （71.87% ）差異不顯著，說明貝萊斯芽孢桿菌B1-4可有效控制葡萄灰霉病。對拮抗菌株B1-4進行溶血試驗無溶血圈出現，表明菌株B1-4是安全的，不具有溶血性。

生物防治具有降低化學農藥污染、改善農作物品質、對生物安全等特點，因此，生物防治具有非常廣闊的發展前景[20-21]。截至2024年，我國登記的用以防治灰霉病的微生物農藥主要包括木霉菌、哈茨木霉菌和芽孢桿菌，劑型多為水分散粒劑（waterdispersiongranules，WG）和可濕性粉劑（wettablepowder，WP）;另外還有甲基營養型芽孢桿菌WP、熒光假單胞桿菌WP和海洋芽孢桿菌WP[22]。但在田間應用時由于土壤微生態環境、菌株定殖能力等影響會出現防治效果不穩定的現象[23-24]，因此，從不同生境分離高效、優質菌種資源是開發生物農藥的重要手段。

表4貝萊斯芽孢桿菌B1-4對葡萄離體果粒的防治效果

Table 4 Control effects of bacillus velezensis B1-4 against grape gray mold disease

注：同列不同小寫字母表示不同處理間在 Plt;0.05 水平差異顯著。 Note：Different lowercaseletters insamecolumn indicate significantdiferences betweendifferenttreatments at Plt;0.05 level.

貝萊斯芽孢桿菌是近年來發現的一種好氧細菌，其分類地位比較波折。2005年，Ruiz-Garcia等7分離到一種細菌，將其命名為貝萊斯芽孢桿菌；2008年，Wang等[25認定貝萊斯芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌為同種異名；2016年，Dunlap等2利用全基因組比較明確了貝萊斯芽孢桿菌的分類地位。植物病原真菌細胞壁主要由糖蛋白、幾丁質與纖維素等物質構成2，通過破壞病原真菌細胞壁的完整性從而控制病原菌生長，是生防菌發揮生防作用的機制之一[28]。

李永麗等2分離出了抑菌范圍較廣的貝萊斯芽孢桿菌Mr12，研究表明，該菌株發酵液對膠孢炭疽菌（Colletorichumgloeosporioides）抑制效果較好。夏明聰等[3研究發現，貝萊斯芽孢桿菌YB-145對禾谷絲核菌（Rhizoctoniacerealis）有較強抑制作用，且該菌株可分泌蛋白酶和 β -1，3葡聚糖酶。Daulaga等3發現，幾丁質酶增強了大白菜抗性，可有效抵抗灰葡萄孢的侵染。本研究分離的貝萊斯芽孢桿菌B1-4在培養基平板上和離體果實上對灰霉病菌均具有較強抑制作用，且該菌株能夠分泌纖維素酶和蛋白酶，這可能是菌株B1-4抑制灰霉病菌的重要原因。

研究發現，有些生防菌株不僅有抑菌作用，還有促生效果[15.32]。劉雪嬌等[33]對貝萊斯芽孢桿菌3A3-15的促生性進行深入研究發現，該菌株具有較強分泌嗜鐵素能力。李坤等對貝萊斯芽孢桿菌TC-52的促生能力進行測定發現，該菌株具有固氮、產鐵載體和產生長素能力，并且提高了水稻胚根的生長量和主根長度。本研究對貝萊斯芽孢桿菌B1-4促生特性進行研究發現，使用其發酵液的100倍稀釋液浸種，可顯著提高黃瓜、小油菜種子的萌發率和胚根長度；且該菌株具有固氮和產鐵載體的能力，這可能是其具有促生作用的原因。以上研究結果展現了菌株B1-4在灰霉病防治上的良好生防潛力，但關于該菌株的定殖能力及田間應用效果，還需做進一步研究。

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