韭菜外植體無害化消毒試驗

韭菜屬于百合科蔥屬多年生宿根植物，原產(chǎn)于中國，又稱起陽草、長生韭、懶人菜等，在我國已有3000多年栽培歷史[1。韭菜育種方式包括常規(guī)有性雜交育種（不同基因型親本雜交，使優(yōu)良基因重新組合，產(chǎn)生具有雙親優(yōu)良性狀的后代）和誘變育種（用物理或化學(xué)因素誘導(dǎo)韭菜遺傳物質(zhì)發(fā)生突變，從而產(chǎn)生新的性狀，從中篩選出優(yōu)良變異個體，培育成新品種[2-3）、組培育種（利用植物細(xì)胞的全能性，在無菌條件下將韭菜的細(xì)胞、組織或器官培養(yǎng)成完整植株，并對培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的變異進(jìn)行篩選和培育，獲得新品種[4-5]）。組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于韭菜育種、保種，不僅可以縮短常規(guī)育種年限，還可以對田間發(fā)現(xiàn)的特異性植株進(jìn)行保種、留種，同時為以后分子雜交育種、遺傳轉(zhuǎn)化工作打下基礎(chǔ)。

在組織培養(yǎng)中，常用氯化汞（升汞）溶液對外植體消毒。汞是重金屬，對環(huán)境具有持久性污染，可以通過空氣、水和土壤傳播，破壞生態(tài)系統(tǒng)平衡，影響植物和動物的生長和繁殖。用次氯酸鈉溶液消毒的研究報道較少。本試驗采用次氯酸鈉溶液消毒，通過探究時間和濃度對材料的影響，篩選對韭菜種子、花器官最合適的消毒辦法。

1材料與方法

1.1試驗材料試驗材料為河北省廊坊市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所提供的韭菜種子、韭菜抽后尚未開放的花器官。選用MS（全配）培養(yǎng)基， pH 值 5.8，120^°C 滅菌 20min 。接種后放到培養(yǎng)間進(jìn)行組織培養(yǎng)。

1.2 材料預(yù)處理

1）種子。選取需要組培的種子，自來水沖洗2min 后放入三角瓶中備用。

2）花器官。于開花期采回需要組培的花器官，加少許洗潔精，在流動的自來水下沖洗 _1～2h ，用濾紙吸干水分放入三角瓶中備用。

1.3外植體消毒方法

1）種子。將預(yù)處理的種子置于超凈工作臺，先用 75% 酒精沖洗3遍，再用 15% 次氯酸鈉溶液浸泡搖洗 7min ，然后用無菌水沖洗4遍后，加無菌水浸泡過夜；第2d，用 10% 次氯酸鈉溶液搖洗4，6，8，10min ，然后用無菌水沖洗4遍后，放入MS培養(yǎng)基中。7d后調(diào)查、計算外植體無菌率，篩選最佳消毒時間。

2）花器官。將預(yù)處理的花器官置于超凈工作臺，先用 75% 酒精沖洗3遍，再用 10% 次氯酸鈉溶液浸泡搖洗 3，5，7，9min ，然后用無菌水沖洗4遍，放入MS培養(yǎng)基中。7d后調(diào)查、計算外植體無菌率，篩選最佳消毒時間。

2結(jié)果與分析

如表1所示，韭菜種子對次氯酸鈉溶液耐受性較好，無菌率隨消毒時間增加而升高，消毒時間為 8min 和 10min 的無菌率均可達(dá)到 90% 以上。因此，韭菜種子用 15% 次氯酸鈉溶液浸泡搖洗 7min ，無菌水浸泡過夜后，再用 10% 次氯酸鈉溶液搖洗8min ，即可達(dá)到最佳消毒效果。

韭菜花器官比較鮮嫩，次氯酸鈉溶液對其損傷較嚴(yán)重，容易造成腐爛。經(jīng)試驗，韭菜花器官在10% 次氯酸鈉溶液中，根據(jù)外植體自身長勢不同，耐受度不同，在消毒 7min 時，花器官無菌率可達(dá) 73.3% ，花苞頂端略變軟，其余部位仍比較硬實，整體損傷不大；當(dāng)消毒時間延長到 9min 時，花器官損傷較重，無菌率有所下降，后期植物體長勢較弱。

表1次氯酸鈉溶液對韭菜種子、花器官消毒效果

3小結(jié)與討論

外植體消毒入瓶是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵一環(huán)。根據(jù)本試驗，在不使用氯化汞溶液消毒的前提下，得到了韭菜花器官、種子的無菌材料。但次氯酸鈉溶液對綠色鮮嫩材料氧化性較強(qiáng)，其能殺菌消毒，也能對植物體造成損傷。因此，在使用次氯酸鈉溶液對外植體消毒時，首先要保證材料自身生長狀態(tài)良好，其次要把握好次氯酸鈉溶液的使用濃度與消毒時間，在消毒過程中仔細(xì)觀察材料的狀態(tài)，以探究最佳的消毒方式。本試驗中，韭菜種子用 15% 次氯酸鈉溶液浸泡搖洗 7min ，無菌水浸泡過夜后，再用 10% 次氯酸鈉溶液搖洗 8min ，可達(dá)到最佳消毒效果；韭菜花器官在10% 次氯酸鈉溶液中，其大部分外植體在消毒 7min 時可達(dá)最佳消毒效果。

參考文獻(xiàn)

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