黃芪建中湯對胃黏膜細胞損傷后細胞增殖及凋亡的影響

中圖分類號 R259 文獻標識碼 A 文章編號 1671-0223（2025）18-1388-05

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慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是胃癌的重要癌前病變，其發病率呈上升趨勢且有年輕化特點[。CAG的發病機制尚未完全明確，但臨床普遍認為與幽門螺桿菌（helicobacterpylori，Hp）感染、自身免疫反應異常、膽汁反流及胃內微生態失衡等因素密切相關。其中， Hp 感染是CAG及胃癌前病變的重要危險因素，其主要致病毒性因子CagA和VacA通過改變宿主細胞信號傳導通路、誘導細胞凋亡等方式導致胃黏膜損傷。此外，胃黏膜上皮細胞的防御功能衰退和免疫微環境失衡也是CAG的關鍵病理特征。細胞增殖與凋亡的平衡是維持胃黏膜正常功能的關鍵機制[3]。在CAG的發病過程中，胃黏膜上皮細胞的增殖能力下降，而凋亡率顯著升高，這種失衡導致胃黏膜的修復能力減弱，進而加重胃黏膜的損傷。近年來，有研究發現[4-5MEK/ERK信號通路在細胞增殖和凋亡中發揮著重要作用，MEK/ERK信號通路的異常激活或抑制與多種疾病的發生發展密切相關。在胃腸道疾病中，MEK/ERK通路的激活能夠促進胃黏膜上皮細胞的增殖和修復，抑制細胞凋亡。黃芪建中湯是傳統中醫經典方劑，具有溫中補虛、緩急止痛的功效。現代藥理學研究表明，黃芪建中湯具有抗炎、抗氧化、促進細胞增殖等多種藥理作用。網絡藥理學研究顯示，黃芪建中湯通過調控癌癥通路、精氨酸和脯氨酸代謝、血管內皮生長因子信號轉導等多條通路發揮對CAG的治療作用。本研究通過體外細胞實驗，探討黃芪建中湯對乙醇誘導的胃黏膜細胞損傷的保護作用及其潛在機制，為黃芪建中湯在CAG治療中的應用提供科學依據。

1材料與方法

1.1實驗材料

（1）實驗動物與細胞：8周齡雄性SD大鼠60只，體重 180±20g ，購自成都達碩實驗動物有限公司，生產許可：SCXK（川）2020-030。人胃黏膜上皮細胞系GES-1，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。細胞使用RPMI-1640培養基培養（含 1% 青鏈霉素），加人 10% 胎牛血清，細胞培養經過2～3代后用于實驗。

（2）主要試劑與儀器：AnnexinVFITC/PI調亡檢測試劑盒，CCK-8試劑盒（北京索萊寶）；CCK-8；Bax、Bcl-2、Caspase-9、cleaved-Caspase-9、MEK、 p -MEK、ERK、 p -ERK［艾博抗（上海）貿易有限公司]。ELX800酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）DYY-7C電泳儀（北京市六一制造廠）；凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）； ThermoCO₂ 培養箱（美國賽默飛世爾公司）。

（3）黃芪建中湯制備：黃芪 9g 、桂枝 9g 、白芍18g 、炙甘草 6g 、生姜 9g 、大棗4枚和飴糖 30g 。按組方比例混合藥材飲片（除飴糖），蒸餾水浸泡1h（溶劑：藥材 ?：1 ），回流提取2次，每次 2h ，用紗布濾過，合并濾液，減壓濃縮，加入 30g 飴糖， -20^°C 保存備用，給藥前復溫，并保證用藥期間每周配藥1次。

（4）黃芪建中湯大鼠含藥血清的制備：大鼠每天灌胃 9.2g/kg 的黃芪建中湯，1日灌胃1次，連續灌胃4周，末次給藥 40min 后腹主動脈采集血液，分離血清，得到黃芪建中湯含藥血清。

1.2實驗方法

（1）細胞分組與藥物干預：本研究將細胞分為4組，每組包含15個獨立的細胞培養皿，具體分組及處理方式如下：空白對照組（細胞正常培養）；模型組（ 0.5μm 乙醇干預 12h ）；黃芪建中湯組（ 0.5μm 乙醇干預 12h ，黃芪建中湯含藥血清干預6h）；黃芪建中湯 +U016 組（用 0.5μm 乙醇處理 ^12h ，黃芪建中湯 +10μm U016干預6h）。細胞干預完成后用于后續實驗。

（2）細胞增殖與活性檢測： ① CCK-8：將細胞以 1×10⁵ 個的密度種植在96孔板上，每組設置3個復孔。待細胞過夜培養貼壁后，按組別進行藥物干預處理，處理完畢后每孔加入 20μlCCK-8 溶液，置于培養箱內培養 2h ， 480nm 處測量吸光值。 ② 細胞克隆：首先將各組藥物干預完成的細胞接種于6孔板（每孔200個細胞）。單個細胞的集落擴增被允許生長 14d 然后用磷酸鹽緩沖液洗滌2次， 70% 乙醇固定，0.5% 結晶紫染色，計數。

（3）細胞凋亡檢測：各組細胞干預完成后，用5μ1PI 和 5μμ AnnexinV/FITC標記，置于室溫避光條件下孵育 15min ，然后用流式細胞儀進行檢測。凋亡細胞百分比表示為早期和晚期凋亡細胞總數，即annexin ΔV+/PI 和annexin ΔV+/PI+ 細胞百分比。采用WesternBlot法檢測細胞Bax、Bcl-2、Caspase-9、cleaved-Caspase-9、MEK、p-MEK、ERK、 Δp -ERK蛋

白表達。

（4）PCNA蛋白表達：采用免疫組織化學染色檢測PCNA蛋白表達。細胞收集后，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，制作爬片并染色，使用DAB（ % ）評估PCAN蛋白陽性面積[1-3]。隨后，冰上裂解細胞并定量蛋白質，在 100^°C 水浴中加熱 10min 后，進行凝膠電泳及轉膜[4-。膜在 5% 脫脂牛奶中封閉 1h ， 4^°C 過夜孵育一抗（稀釋倍數 1：1000 ），TBST漂洗后室溫孵育二抗2h，再用TBST漂洗3遍，使用ECL法曝光，并用凝膠成像系統分析，以 β -actin為內參計算蛋白相對表達水平。

1.3數據分析方法

運用SPSS22.0統計學軟件分析處理數據，正態分布的計量資料采用“均數 ± 標準差”表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD- ^-t 檢驗；計數資料計算百分率，組間率比較采用χ² 檢驗。以 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組細胞增殖與凋亡比較

四組間的細胞增殖率、細胞凋亡率、克隆數和PCAN蛋白表達水平比較，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ）。兩兩比較結果顯示，與空白對照組相比，模型組細胞增殖率、克隆數和PCAN蛋白表達水平均降低，細胞凋亡率升高（ Plt;0.05 ）；與模型組相比，黃芪建中湯組細胞增殖率、克隆數和PCAN蛋白表達水平均升高，細胞凋亡率降低（ Plt;0.05 ）；與黃芪建中湯組相比，U016抑制劑干預后，細胞增殖率、克隆數降低，細胞凋亡率升高（ Plt;0.05 ），PCAN陽性表達率有下降趨勢。結果見表1、圖1。

圖1黃芪建中湯對胃黏膜細胞損傷后細胞凋亡率、細胞克隆數量及PCAN蛋白表達的影響。A流式細胞術檢測細胞凋亡率；B細胞克隆形成實驗檢測細胞克隆數；C免疫組織化學檢測PCAN蛋白陽性表達情況（DAB染色， 200× ）

表1各組細胞增殖與凋亡比較

注：與空白對照組相比， ?Plt;0.05 ；與模型組相比， ^#P?0.05 ；與黃芪建中湯組相比， ^oP?0.05，

2.2各組細胞凋亡蛋白的表達比較

四組間的Bcl-2蛋白，Bax、Caspase-9和cleaved-Caspase-9蛋白表達水平比較，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ）。兩兩比較結果顯示，與空白對照組相比，模型組細胞中Bcl-2蛋白表達下降，Bax、Caspase-9和cleaved-Caspase-9蛋白表達升高（ Plt;0.05 ）；與模型組相比，黃芪建中湯細胞中Bcl-2蛋白表達升高，Bax、Caspase-9和cleaved-Caspase-9蛋白表達降低（ Plt;0.05 ）；與黃芪建中湯組相比，U016抑制劑干預后，細胞中Bcl-2蛋白表達有降低趨勢，Bax和cleaved-Caspase-9蛋白表達升高（ Plt;0.05 ）。結果見表2、圖2。

圖2黃芪建中湯對胃黏膜細胞損傷后細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-9和cleaved-Caspase-9蛋白表達的影響。1：空白對照組；2模型組；3黃芪建中湯組；4黃芪建中湯 +U016 組

表2各組細胞凋亡蛋白的表達比較

注：與空白對照組相比， ?Plt;0.05 ；與模型組相比， #P?0.05 ；與黃芪建中湯組相比， @Plt;0.05.

2.3各組細胞中的MEK通路蛋白表達水平比較

四組間的ERK、 -ERK、MEK與 -MEK蛋白表達水平比較，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ）。兩兩比較結果顯示，與空白對照組相比，模型組細胞中ERK、 Δp^. -ERK、MEK與 p -MEK蛋白表達均下降（ Plt;0.05 ）；與模型組相比，黃芪建中湯細胞中ERK、 Δp? -ERK、MEK與 -MEK蛋白表達均升高（ Plt;0.05 ）；與黃芪建中湯組相比，U016抑制劑干預后，細胞中 -ERK、MEK與 p -MEK蛋白表達均下降（ Plt;0.05 ）。結果見表3，圖3。

表3各組細胞中的MEK通路蛋白表達水平比較

注：與空白對照組相比， ?Plt;0.05 ；與模型組相比， #P?0.05 ；與黃芪建中湯組相比， @Plt;0.05，

圖3黃芪建中湯對胃黏膜細胞損傷后細胞中ERK、p-ERK、MEK與p-MEK蛋白表達的影響。1空白對照組；2模型組；3黃芪建中湯組；4黃芪建中湯+U016組

3討論

CAG作為一種常見的消化系統疾病，其病理特征主要表現為胃黏膜的萎縮、腺體減少以及腸上皮化生等。近年來，隨著生活方式的改變和人口老齡化加劇，CAG的發病率逐漸上升，且呈現出年輕化趨勢。CAG不僅是胃癌的重要癌前病變，還嚴重影響患者的生活質量[8。因此，尋找有效的治療方法以延緩或逆轉CAG的進展具有重要的臨床意義。

在現代醫學中，CAG的治療多以控制癥狀、改善胃黏膜微環境、預防癌變為主，但目前尚缺乏特效藥物。傳統中醫藥在治療CAG方面積累了豐富的經驗，許多經典方劑在臨床實踐中顯示出良好的療效。黃芪建中湯作為中醫經典方劑之一，具有溫中補虛、緩急止痛的功效，被廣泛應用于脾胃虛寒型胃皖痛、胃潰瘍等疾病的治療。現代藥理學研究表明，黃芪建中湯具有抗炎、抗氧化、促進細胞增殖等多種藥理作用，但其在CAG治療中的具體作用機制尚不明確[。本研究結果顯示，黃芪建中湯能夠顯著提高乙醇刺激下GES-1細胞的增殖率，并減少細胞凋亡。具體表現為，與模型組相比，黃芪建中湯組細胞增殖率顯著升高，凋亡率顯著降低，且Bcl-2、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK、PCNA蛋白表達升高，Bax、Caspase-9、cleaved-Caspase-9蛋白表達降低，提示黃芪建中湯通過激活MEK/ERK信號通路，促進細胞增殖并抑制凋亡，從而減輕乙醇對胃黏膜細胞的損傷。本研究進一步分析發現，黃芪建中湯對MEK/ERK信號通路的調控作用是其發揮細胞保護作用的關鍵機制。模型組細胞中ERK、p-ERK、MEK與p-MEK蛋白表達均下降，而黃芪建中湯干預后，這些蛋白的表達顯著升高。與既往[研究中發現的理中湯通過調控Raf/MEK/ERK信號通路修復大鼠胃潰瘍的機制相似。此外，黃芪建中湯還通過調節凋亡相關蛋白（如增加Bcl-2，減少Bax、Caspase-9等）來保護細胞。黃芪建中湯在促進胃黏膜細胞增殖和抑制凋亡方面具有顯著效果，其作用機制與激活MEK/ERK信號通路

密切相關。

本研究結果顯示，MEK抑制劑U016能夠顯著抑制黃芪建中湯的藥效，進一步證實了MEK/ERK信號通路在黃芪建中湯發揮作用中的重要性，表明黃芪建中湯通過激活MEK/ERK信號通路，促進細胞增殖并抑制凋亡，從而減輕乙醇對胃黏膜細胞的損傷[2-13]MEK/ERK信號通路在細胞增殖、分化和凋亡中起著關鍵作用，其激活能夠促進胃黏膜上皮細胞的修復和再生。黃芪建中湯作為一種傳統中藥方劑，已被證實具有抗炎、抗氧化和調節細胞凋亡等多種藥理作用。在本研究中，通過使用MEK抑制劑U016，我們觀察到黃芪建中湯的促增殖和抗凋亡效果被顯著抑制，這表明黃芪建中湯的作用機制與MEK/ERK信號通路的激活密切相關。黃芪建中湯對胃黏膜的保護作用還可能與調節炎癥因子、增強胃黏膜屏障功能有關。這些綜合作用使得黃芪建中湯在治療胃黏膜損傷方面具有顯著的療效，其機制可能涉及多條信號通路的協同調節[14]。因此，黃芪建中湯通過激活MEK/ERK信號通路，不僅促進了細胞的增殖和存活，還通過調節炎癥反應和維持胃黏膜屏障功能，進一步增強了對胃黏膜的保護作用[15]

綜上所述，黃芪建中湯能夠通過激活MEK/ERK信號通路，促進胃黏膜細胞的增殖并抑制凋亡，從而減輕乙醇對胃黏膜細胞的損傷，為黃芪建中湯在治療慢性萎縮性胃炎中的應用提供了新的實驗依據。未來的研究可以進一步探討黃芪建中湯在其他病理條件下的作用機制，以及其在臨床治療中的應用潛力。

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[2025-04-07收稿]