小麥八氫番茄紅素合成酶家族的生物信息學分析及表達模式檢測

2025-10-03 00:00:00石永春喬占鋒盧了一李歡歡

河南師范大學學報(自然科學版) 2025年5期

中圖分類號：Q527 文獻標志碼：A 文章編號：1000-2367（2025）05-0016-08

類胡蘿卜素是類異戊二烯的衍生物，多為40C化合物[1-2]，屬于脂溶性色素[3]，參與植物光系統的組裝，并與植物光保護機制有關[2].八氫番茄紅素合成酶（phytoene synthase，PSY）是催化植物中類胡蘿卜素合成途徑的第一步，使兩個牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）合成一分子的八氫番茄紅素（phytoene）[4-5].植物中一般含有多個PSY基因，如番茄（Solanum lycopersicum）[4]、水稻（Oryza sativa）[6]和玉米（Zea mays）[7]中各存在3個，木薯（Manihot esculenta Crantz）[8]中有2個，擬南芥（Arabidopsisthaliana）中只存在1個[9] PSY 基因的功能在雙子葉植物中研究較多.如過表達PSY基因使油菜（Brassicacampestris）籽中類胡蘿卜素含量增加 43～50 倍[10]，使擬南芥愈傷組織和根中的類胡蘿卜素含量顯著增加[11]；沉默煙草（Nicotiana tabacum）中的 PSY 基因[12]或敲除番茄中的PSY基因[13]會造成植株的光合效率下降，以及植株對強光的敏感性.PSY基因的表達受到ABA、鹽、干旱和光周期等因素的影響[5].如擬南芥在光照下誘導光敏色素互作因子PIFl（phytochrome interacting factors）快速降解，導致PSY基因表達增加[14].PSY基因家族的不同成員在植物不同組織中表達情況不同.如番茄 SLPSY1主要在果實中表達， SlP_- SY2 主要在花和葉片中表達，SLPSY3 則只在根部表達[13].但單子葉植物中PSY基因家族的表達差異和功能研究僅有少量報道，如水稻中OsPSY1基因受光誘導表達，OsPSY3基因在ABA、鹽和干旱處理過程中上調表達[6];藏紅花（Crocus satius）的CsPSY1主要在葉片中表達，CsPSY2主要在柱頭中表達，CsPSY3主要在根部表達[15]

小麥屬單子葉植物，也是我國主要的糧食作物之一.小麥中報道了3個PSY基因[16].其中 TaPSY1與小麥籽粒著色有關，影響小麥籽粒中類胡蘿卜素含量[17]，TaPSY3對干旱和高溫脅迫敏感[16].可見研究PSY基因的功能和表達模式對于小麥抗逆育種和籽粒質量調控都有重要作用.本文以擬南芥和水稻 PSY蛋白（AtPSY和OsPSY1）的氨基酸序列為模板，在小麥基因組數據庫中檢索，對獲得的小麥PSY蛋白序列進行生物信息學分析，并對其相應激素和脅迫的表達模式進行初步研究，以期為小麥PSY家族研究提供理論參考.

1 材料和方法

1.1 實驗材料及處理方法

小麥 PSY 蛋白序列的獲取：以擬南芥 PSY（AtPSY，GI：NP_001031895）和水稻 PSY1（OsPSY1，GI：NP_001389894）蛋白的氨基酸序列為模板，在小麥數據庫（http：//wheatomics.sdau.edu.cn/，Chinese Springprotein vl.O）中檢索，選取與 AtPSY 和OsPSY1同源性都高于 65% 且含有PSY 特有的天冬氨酸富集區和酶活性位點YAKTF和RAYV的序列進行分析.

基因表達分析所用小麥為豫麥49和西農979，在氣候室（溫度 20°C ;相對濕度 40% ;光周期 ^16h 光照：8h 黑暗；光照強度 3000lx）培養至兩葉一心期，分別用 250mmol?L^-1NaCl?100μmol?L^-1 ABA、 15% PEG6000 500μmol?L^-1 MeJA .100mmol?L^-1 SA處理，在處理 0.3，6，24h 取展開葉，液氮速凍后儲藏至一 80°C 保存備用.每種處理設3個生物學重復.

1.2 生物信息學分析方法

多序列對比采用DNAMAN軟件進行，進化分析用MEGA7軟件Neighbor-Joining 法繪制系統進化樹.采用 ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件進行蛋白質理化性質分析.亞細胞定位的預測采用 Cello（http：//celo.life.nctu.edu.tw/）在線軟件進行，采用 SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page = /NPSA/npsa_sopma.html）在線工具進行二級結構分析.采用MOTIF在線軟件（https：//www.genome.jp/tools/motif/）分析蛋白質的基序.TaPSY基因的啟動子序列從 WheatOmics1.0在線數據庫（http：//202.194.139.32/）獲取，選取基因起始密碼子ATG上游2000bp的序列，用 PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare）在線軟件分析順式作用元件.

1.3 RNA提取和RT-qPCR

從小麥數據庫獲得9個TaPSY基因的ORF序列，并據此設計引物（附錄表 S1）.按照RNA提取試劑盒（北京諾貝萊生物科技有限公司）的方法，將凍存的小麥葉片用液氮研磨為勻漿后提取RNA.參照反轉錄試劑盒（北京諾貝萊生物科技有限公司）的方法將RNA反轉錄為cDNA，以 β actin作為內參基因，用熒光定量PCR試劑盒（北京諾貝萊生物科技有限公司）的方法進行RT-qPCR檢測.

1.4 數據分析

采用Excel2019進行數據分析，采用Student's T -test進行差異顯著性分析.

2 結果與分析

2.1小麥TaPSY基因家族成員鑒定

以AtPSY（GI：NP_001031895）和OsPSY1（GI：NP_001389894）的氨基酸序列為模板，在小麥基因組數據庫中檢索，將所獲序列采用 SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和 Pfam（https：//pfam.xfam.org/）在線軟件進行結構域預測，去除不含PSY完整結構域的蛋白，共獲得9個高度同源序列，分別命名為TaPSY1-9（附錄表 S2）.

2.2 小麥TaPSY的進化分析

通過MEGA軟件對比TaPSY1-9、AtPSY和OsPSY1蛋白的氨基酸序列，并構建系統進化樹（圖1）.發現9個小麥 PSY蛋白可以聚為3組，其中 TaPSYl、2、3為第I組，與OsPSY1和 AtPSY親緣關系較近；

TaPSY4、5、6聚為第Ⅱ組；TaPSY7、8、9聚為第Ⅲ組.在小麥基因組數據庫分析 TaPSY基因在小麥染色體的分布情況，發現TaPSY1、2、3分別位于小麥7A、7B、7D染色體，含有7個外顯子； TaPSY4.5.6 分別位于染色體5A、5B、5D的短臂，含有6個外顯子和5個內含子;TaPSY7、8、9分別位于染色體5A、5B、5D的長臂，含有4個外顯子和3個內含子.比對上述蛋白質的氨基酸序列，發現TaPSY序列的長度變化從 391到428個氨基酸，且部分區域高度保守，尤其在PSY家族共有的天冬氨酸富集區：DXXXD/DXXXD（圖2中綠色方框內），以及酶活位點：YAKTF和RAYV基序（圖2中黑色方框內）.

圖1進化樹及染色體分布分析

圖2PSY氨基酸序列比對

Fig.2 Alignment of the amino acid sequence of PSY

2.3TaPSY的理化性質和亞細胞定位分析

采用ProtParam分析TaPSY的理化性質（附錄表S3），發現TaPSY的氨基酸數目在 391～428 之間，相對分子質量在 43.74～47.66kDa 之間.第I組TaPSY肽鏈最長，氨基酸數目分別為427、424、428個；第Ⅱ組肽鏈長度最短，氨基酸數目分別為396、397、391;第Ⅲ組肽鏈長度居中，氨基酸數目分別為413、403、401.在等電點（pI）方面，除TaPSY5為6.98，屬于中性蛋白質以外，其余TaPSY的pI皆大于7，屬于偏堿性蛋白質，以 TaPSY9的pI值最大（9.25）.9個小麥PSY蛋白質都屬于疏水性蛋白質，其中第 I 組TaPSY的疏水性最強，分別為 -0.369、-0.399、-0.354 ;第I組TaPSY居中;第Ⅲ組TaPSY疏水性最弱，分別為一O.188、一0.154，-0.134.TaPSY 的不穩定系數皆大于4O，其中第一組TaPSY 的不穩定系數接近OsPSY1，第三組TaPSY的不穩定系數接近 AtPSY.亞細胞定位預測結果顯示，葉綠體的分值最高，說明 TaPSY都定位于葉綠體（附錄表S4）.

2.4 二級結構和基序分析

分析PSY蛋白的二級結構和基序（圖3），發現所有PSY蛋白都只含有一個SQS-PSY基序（附錄表S5）.將所有PSY蛋白的基序用綠色方框對齊，發現PSY蛋白基序內的二級結構高度相似，均以 a- 螺旋為主，在第300、350，以及370個aa附近存在 β -轉角結構.在綠色方框外序列的二級結構存在較大的差別.TaP-SY6、8、9 的N末端結構以 a- 螺旋為主，TaPSY1、2、3、4、5、7的N末端以無規則卷曲居多，而TaPSY1、2、3 的N末端存在較多的 β- 折疊結構.綠色方框外，TaPSY的C末端結構較為相似，大多以 α^- 螺旋和無規則卷曲結構結尾.

2.5 啟動子分析

為分析 TaPSY基因的表達調控機制，通過PlantCARE軟件分析了TaPSY基因啟動子的順式作用元件.發現除一些核心啟動子響應元件外， TaPSY 基因的啟動子中還存在光響應元件、干旱響應元件、低溫響應元件、缺氧信號響應元件、生長素響應元件、赤霉素響應元件、水楊酸響應元件、脫落酸響應元件、茉莉酸甲酯響應元件等（附錄表S6），可見TaPSY基因參與多種生長發育和非生物脅迫響應過程.

2.6小麥TaPSY響應多種脅迫的表達模式分析

RT-qPCR結果（圖4）顯示，鹽脅迫處理后，TaPSY1-6基因的表達量在豫麥49 和西農979 的葉片中都顯著降低，且在 6h 時降至最低水平，在 24h 時基本恢復； TaPSY7 在豫麥49中變化不明顯，但在西農979中在鹽脅迫 24h 時表達量達到 ^0h 的1.71倍；在豫麥49中 TaPSY8 和9在鹽脅迫 24h 時表達量都顯著高于對照，而在西農979中顯著低于對照.

MeJA處理后，在豫麥49中， TaPSY1-6 從 0～24h 都顯著下調，而TaPSY7-9則都在和 6h 顯著上調，分別達到對照水平的 6～8 倍，而后在 24h 顯著下調并低于對照水平.在西農979中， TaPSY1-6 從0～6h 都顯著下調，而 24h 時上調并顯著高于對照;TaPSY7-9在 ⁶h 顯著上調，并高于對照，但僅TaP-SY7在 24h 時還維持高水平表達.

PEG6000處理后，在豫麥49中， TaPSY1-6.9 從 ^0h 到 24h 都出現先降低再恢復的表達趨勢，但 TaP_- SY7則在0和 24h 都出現高表達， TaPSY8 則出現先輕微升高，再持續下降的表達趨勢.在西農979中，所有TaPSY基因從 0～24h 顯著表達水平都下降.

ABA 處理后，豫麥49中 TaPSY1-6都出現先降低再恢復的表達趨勢，但西農979中 TaPSY1-6在24h 的恢復程度顯著高于豫麥49，約為 ^0h 的2倍.TaPSY7在豫麥49中表達變化不明顯，但在西農979中其 24h 表達量為 ^0h 的2倍.TaPSY8和9在ABA處理后顯著下調.

SA處理后，豫麥49中TaPSY的表達變化較為一致，大多在 ⁶h 時表達量達到最低，之后恢復.但在西農979中 TaPSY1.2.3 的表達量先降低后在 24h 升高，接近 ^0h 時的2倍，其他TaPSY都出現先下降，24h 時又恢復的趨勢.

3討論

PSY屬于類異戊二烯生物合成酶C1超家族，是植物類胡蘿卜素合成途徑的限速酶[6.17].本研究依據擬南芥和水稻 PSY的蛋白序列，在小麥中鑒定到9個TaPSY基因，分布于6條染色體上.分析蛋白質一級結構發現，TaPSY1、2、3的第1個天冬氨酸富集區DELVD后的第10 個氨基酸為谷氨酰胺（圖1），CAO 等[18]在番茄中發現的高活性 PSY1具有相同結構，FLOWERIK 等[16]發現 TaPSY1具有高酶活性，推測第I組

TaPSY的酶活性都較高.二級結構分析發現，9種 TaPSY只含有 SQS-PSY基序，該基序含有2個富含天冬氨酸的結構用于結合底物[19]，基序內 α 螺旋， β 折疊， β? -轉角在數目和位置上都高度一致（圖2和圖3），證明TaPSY在功能上高度保守.

注：豎線從長到短依次為α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規則卷曲

圖3二級結構分析

Fig.3 Analysis of secondary structure

不同TaPSY基因的表達調控機制不同.在煙草中，MeJA處理 8h 時，NtPSY1上調約為NtPSY2的7倍[12].鹽處理后，水稻葉片中OsPSY3基因表達出現上調[6].用 ABA、MeJA、SA 處理禾本科植物結縷草（Zoysiajaponica）[20]，其 ZjPSY表達量均出現先下調后恢復的趨勢.干旱處理玉米[21]，ZmPSY2、3在葉片中的表達量持續上調，但 ZmPSY1 的表達量波動很小.小麥PSY基因啟動子的分析結果顯示，TaPSY1-9啟動子都含有光反應元件、ABA和MeJA響應元件， TaPSY1-6 啟動子還含有受干旱誘導的MYB結合位點， TaPSY2.4 啟動子含有參與水楊酸反應的順式作用元件.RT-qPCR的檢測結果表明，兩種小麥的TaPSY1-6在ABA處理6h 后都出現下調，在 24h 后恢復； TaPSY7-9 的表達變化在不同的小麥品種中變化較大，這與結縷草ZjPSY的表達情況類似.MeJA處理后，兩種小麥中 TaPSY1-6 表達量在 6h 時都顯著下調，而TaPSY7-9則顯著上調.豫麥49較西農979更為抗旱，在PEG6000模擬干旱處理小麥后，不同小麥中的PSY表達情況不同，豫麥49葉片中PSY的表達出現先降低后升高的趨勢，而西農979則持續降低，這可能與材料間的表達調控機制不同有關.

圖4小麥TaPSY基因在不同脅迫下的相對表達水平

Fig.4 Relative expression levels of TaPSY genes in wheat under different treatment

4結論

在小麥基因組數據庫中鑒定到9個八氫番茄紅素合成酶蛋白，發現其可聚為3組，分析蛋白序列的二級結構和結構域發現，它們都含有 SQS-PSY基序，該基序在不同蛋白序列的二級結構中高度保守.啟動子分析顯示小麥PSY基因對光、干旱、ABA等因素響應.RT-qPCR 檢測了不同處理下抗旱性不同的小麥中 TaP-SY家族的表達差異，發現抗旱性更強的豫麥49中，TaPSY7和TaPSY8對MeJA和PEG6000響應強烈.

附錄見電子版（DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2024.01.10.0003）.

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Bioinformatic identification and expresson profile analysis of PSY gene family in wheat

Shi Yongchun1，Qiao Zhanfengl，Lu Liaoyi2，Li Huanhuan1 （1.College of Life Sciences，Henan Agricultural University，Zhengzhou 45oo46，China; 2.Henan Provincial People's Victory Canal Security Center，Xinxiang 453o0o，China）

Abstract：Phytoene synthase（PSY）is a rate limiting enzymein thecarotenoid synthesis pathway in plants.Increasing theexpressionlevelofPSYgenehelpstoincreasethecarotenoidcontentinplants，therebyimproving photosynthesisand grain quality.However，thereis stillasignificant gap inresearch on PSY in wheat（Triticum aestium）.Here，thePSY protein sequences of Arabidopsis and rice were used as templates and screned 9 homologous sequences from a wheat database.Through bioinformaticsanalysis，it was found thattheycan beclustered intothree groups，allof whichare hydrophobic proteins located in chloroplasts and contain SQS-PSY motifs. α -helix is dominant in secondary structure of PSY in wheat. After analyzing the cis-acting element，thehormone responsive elements such as response toabscisic acid（ABA），salicylicacid（SA），methyl jasmonate（MeJA），and stress responsive elements were found in promoters of TaPSY genes. RT-qPCR technique was used to detecttheexpressionlevelsofTaPSY1-6inthe leavesof wheat seedlings treated withABA，SA，MeJA，and polyethyleneglycol 6000（PEG6ooo）for6hours，respectively.Itwas foundthatthey were significantlydownregulated.However，theexpression levels of TaPSY7-9 varied greatlyamong wheat varieties，suggestingthatthe expressonlevelsof TaPSY7-9arerelated to the stressresistance differences betweenvarieties.Thebioinformaticsanalysis of thewheatPSYproteinfamilyinthisstudypro vides a theoretical reference for further exploring the function of wheat PSY ， and the expression profile analysis of the wheat PSY gene family provides new candidate genes for wheat resistance breeding.

Keywords： wheat;PSY;bioinformatics;promoter;expression analysis

[責任編校劉洋趙曉華]

表S1 引物序列

Tab. S1 Primer sequences