大花型蝴蝶蘭外植體組培褐化控制和原球莖誘導(dǎo)方法探索

關(guān)鍵詞：大花型蝴蝶蘭；外植體；褐化控制；原球莖誘導(dǎo)中圖分類號(hào)：S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：BDOI：10.19345/j.cnki.1674-7909.2025.10.021文章編號(hào)：1674-7909（2025）10-100-4

0 引言

蝴蝶蘭因其花形優(yōu)美、色彩豐富、花期長(zhǎng)等特性，被譽(yù)為“蘭花皇后”。大花型蝴蝶蘭更是以其碩大的花朵和優(yōu)的姿態(tài)備受青睞［1］。然而，傳統(tǒng)的蝴蝶蘭繁殖方式效率較低，難以滿足市場(chǎng)需求。組織培養(yǎng)技術(shù)作為一種高效的無性繁殖手段，為大花型蝴蝶蘭的快速繁殖和優(yōu)良品種推廣提供了有效途徑［2］。在大花型蝴蝶蘭的組培過程中經(jīng)常出現(xiàn)外植體褐化的問題，其嚴(yán)重影響了組培苗的生長(zhǎng)和繁殖效率［3］。褐化不僅影響外植體的存活率，還會(huì)抑制愈傷組織的形成和原球莖的誘導(dǎo)，最終導(dǎo)致組培失敗。因此，探究一種有效的褐化控制方法對(duì)提高大花型蝴蝶蘭組培的成功率至關(guān)重要［4］。

原球莖誘導(dǎo)是蝴蝶蘭組培的重要環(huán)節(jié)，其誘導(dǎo)效果直接影響組培苗的質(zhì)量和數(shù)量。目前，大花型蝴蝶蘭原球莖誘導(dǎo)率普遍較低，且存在誘導(dǎo)周期長(zhǎng)、畸形率高的問題［5］。因此，優(yōu)化大花型蝴蝶蘭原球莖誘導(dǎo)條件，提高誘導(dǎo)效率和誘導(dǎo)質(zhì)量已成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)［6］。此次研究通過優(yōu)化外植體選擇、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合及培養(yǎng)條件等，提高原球莖的誘導(dǎo)效率，并優(yōu)化原球莖誘導(dǎo)條件，以探索大花型蝴蝶蘭外植體組培過程中褐化的有效控制方法，為大花型蝴蝶蘭的高效繁殖提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

研究選用大花型蝴蝶蘭品種“大辣椒”作為試驗(yàn)材料。選擇健康無病蟲害的大花型蝴蝶蘭植株，采集其葉片和花梗作為外植體來源。其中，葉片選擇幼嫩葉片，剪取約 2cm 的葉片組織。花梗選取即將開花的花梗，剪取長(zhǎng)度 2～3cm 的幼嫩部分。材料的采集時(shí)間均在9：00左右，采集后立即進(jìn)行清洗和初步消毒，放入 4^°C 冰箱進(jìn)行保存。

試驗(yàn)試劑主要包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、蔗糖、瓊脂、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑和消毒劑。其中，培養(yǎng)基選取MS培養(yǎng)基（比克曼生物公司生產(chǎn)），添加 30g/L 蔗糖、 、7g/L 瓊脂， pH 值調(diào)至5.8；抗氧化劑采用維生素C、聚乙烯吡咯烷酮和檸檬酸；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑采用萘乙酸和6-芐氨基嘌呤；消毒劑采用 75% 的乙醇、0.1% 的氯化汞溶液。培養(yǎng)基通過 120^°C 高壓蒸汽滅菌，滅菌時(shí)間為 18min 。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒

首先，將采集到的大花型蝴蝶蘭的葉片和花梗用流水沖洗 30min ，去除表面的污漬。其次，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用 75% 的乙醇浸泡 1min ，用無菌水沖洗2～3 次，再使用 0.1% 的氯化汞溶液進(jìn)行消毒，其中葉片消毒 10min ，花梗消毒 12min 。最后，將消毒后的材料用無菌水沖洗5～6 次，放在無菌濾紙上吸干水分，備用。

1.2.2 褐化控制試驗(yàn)

大花型蝴蝶蘭的褐化控制試驗(yàn)是將消毒后的外植體分別接種到添加了不同質(zhì)量濃度的抗氧化劑的培養(yǎng)基中。抗氧化劑使用維生素C、聚乙烯吡咯烷酮和檸檬酸。其中，維生素C 的質(zhì)量濃度分別為 50mg/L?100mg/L?150mg/L?200mg/L ，聚乙烯吡咯烷酮的質(zhì)量濃度分別為 100mg/L?200mg/L 、500mg/L、1000mg/L ，檸檬酸的質(zhì)量濃度分別為100mg/L_?200mg/L_?300mg/L_?400mg/L_?

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種10個(gè)外植體［7］。試驗(yàn)的周期為 60d ，每隔10 d 觀察并記錄外植體的褐化程度、存活率和生長(zhǎng)情況。外植體的褐化率和存活率計(jì)算公式分別見式（1）、式（2）。

褐化率 出現(xiàn)的褐化外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù) ×100% （1）

存活率 ：=， 存活外植體數(shù)/接種外植體總數(shù) ×100%

1.2.3 原球莖誘導(dǎo)試驗(yàn)

大花型蝴蝶蘭原球莖誘導(dǎo)試驗(yàn)是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將消毒后的外植體接種于添加了不同質(zhì)量濃度萘乙酸和6-芐氨基嘌呤的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。其中，萘乙酸的質(zhì)量濃度分別為 0.05mg/L，0.10mg/L 、0.20mg/L?0.50mg/L，6- 芐氨基嘌呤的質(zhì)量濃度分別為 0.1mg/L，0.5mg/L，1.0mg/L，2.0mg/L 。

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種10個(gè)外植體。試驗(yàn)的周期為 60d ，每隔10 d 觀察并記錄外植體的直徑、顏色和形態(tài)等特征。原球莖誘導(dǎo)率計(jì)算公式見式（3）。

原球莖誘導(dǎo)率 誘導(dǎo)出原球莖的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù) ×100% （3）

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

研究采用Excel 軟件對(duì)采集到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，通過SPSS26.0 軟件對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過Duncan's 進(jìn)行多重比較，以確定不同處理之間的顯著性差異［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗氧化劑對(duì)外植體褐化的影響

研究首先探究了不同抗氧化劑對(duì)外植體褐化的影響，分析了大花型蝴蝶蘭的外植體褐化率和存活率，結(jié)果如圖1所示。圖1（a）中，當(dāng)維生素C質(zhì)量濃度從 0mg/L 增加至 100mg/L 時(shí)，外植體的褐化率從 47.30% 下降到 11.89% ，存活率從 68.26% 增加到89.64% ；當(dāng)維生素C 質(zhì)量濃度從 100mg/L 增加至200mg/L 時(shí)，外植體的存活率顯著降低。圖1（b）中，聚乙烯吡咯烷酮質(zhì)量濃度為 1500mg/L 時(shí)，外植體的存活率最高，為 95.67% ；聚乙烯吡咯烷酮質(zhì)量濃度從 0mg/L 增加至 1000mg/L 時(shí)，褐化率從59.25% 下降到 18.36% 。圖1（c）中，檸檬酸質(zhì)量濃度 為 300mg/L 時(shí) ，外 植 體 的 存 活 率 最 高（為86.56% ），褐化率較低（為 15.08% ）。綜上可知，當(dāng)維生素C 質(zhì)量濃度為 100mg/L 、聚乙烯吡咯烷酮質(zhì)量濃度為 1 500mg/L 、檸檬酸質(zhì)量濃度為 300mg/L 時(shí)，外植體的存活率最高，且能有效控制褐化。

2.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)原球莖誘導(dǎo)的影響

研究分析了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)大花型蝴蝶蘭原球莖誘導(dǎo)率和直徑的影響，結(jié)果如圖2所示。圖2（a）中，當(dāng)萘乙酸質(zhì)量濃度為 0.05mg/L 時(shí)，原球莖誘導(dǎo)率和直徑分別為 43.82% 和 0.89mm ；萘乙酸質(zhì)量濃度增加到 0.20mg/L 時(shí)，原球莖誘導(dǎo)率增加到 59.24% ；萘乙酸質(zhì)量濃度為 0.50mg/L 時(shí)，誘導(dǎo)率下降到 43.56% 。圖2（b）中，當(dāng)6-芐氨基嘌呤質(zhì)量濃度為 0.1mg/L 時(shí)，原球莖誘導(dǎo)率和直徑分別為36.52% 和 0.98mm ；當(dāng)6-芐氨基嘌呤質(zhì)量濃度增加到 2.0mg/L 時(shí)，原球莖的誘導(dǎo)率高達(dá) 72.35% 。結(jié)果表明，萘乙酸和6-芐氨基嘌呤在適宜質(zhì)量濃度下能夠顯著提高大花型蝴蝶蘭原球莖的誘導(dǎo)率和直徑。萘乙酸質(zhì)量濃度為 0.20mg/L 時(shí)，原球莖誘導(dǎo)率最高。

圖1 不同抗氧化劑對(duì)外植體褐化率和存活率的影響

圖2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)原球莖誘導(dǎo)的影響

3 討論與結(jié)論

研究針對(duì)大花型蝴蝶蘭繁殖培育效率和存活率較低的問題，探究了大花型蝴蝶蘭外植體組培過程中的褐化控制和原球莖誘導(dǎo)條件。試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同抗氧化劑在適宜質(zhì)量濃度下能夠有效清除外植體在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的酚類等有害物質(zhì)，從而減輕褐化現(xiàn)象。其中，維生素C 質(zhì)量濃度從 0mg/L 增加至 100mg/L 時(shí)，褐化率顯著下降，存活率顯著提高，與崔文寧等［9］的研究結(jié)果一致。聚乙烯吡咯烷酮和檸檬酸質(zhì)量濃度分別為 1500mg/L 和 300mg/L 時(shí)表現(xiàn)出最佳的褐化控制效果，與李麗紅等［10］的研究結(jié)果存在差異，可能與外植體種類和試驗(yàn)條件不同有關(guān)。在原球莖誘導(dǎo)方面，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用顯著提高了原球莖的誘導(dǎo)率。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，萘乙酸質(zhì)量濃度從 0mg/L 增加至 0.20mg/L，6- 芐氨基嘌呤質(zhì)量濃度從 0mg/L 增加至 2.0mg/L 時(shí)，原球莖的誘導(dǎo)率顯著提高。

研究結(jié)果表明，維生素C、聚乙烯吡咯烷酮、檸檬酸等抗氧化劑在適宜質(zhì)量濃度下能夠有效控制大花型蝴蝶蘭外植體的褐化程度，提高外植體的存活率；同時(shí)，萘乙酸和6-芐氨基嘌呤等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在適宜質(zhì)量濃度下能夠顯著提高大花型蝴蝶蘭原球莖的誘導(dǎo)率。此次研究為大花型蝴蝶蘭的高效繁殖提供了技術(shù)支持，有助于提高其組培繁殖的成功率和繁殖效率。未來研究將進(jìn)一步擴(kuò)大試驗(yàn)材料范圍，驗(yàn)證研究結(jié)果在其他蝴蝶蘭品種中的適用性。

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Abstract： This study aims to explore effective control of browning and methods to enhance the induction rate of protocorms during the tissue culture process of large flowered Phalaenopsis ex? plants， in order to improve the breeding efficiency and survival rate of large flowered Phalaenopsis va? rieties. Treating explants with different concentrations of antioxidants to investigate their control ef? fect on browning. At the same time， experiments were conducted on the induction of protocorms using different concentrations of plant growth regulators and cultivation conditions. When the concentra? tions of vitamin C， polyvinylpyrrolidone， and citric acid were 100mg/L ， 1500mg/L ， and 300mg/L ， respectively， the browning rate of explants significantly decreased and the survival rate significantly increased. In terms of protocorm induction， the highest protocorm induction rate was achieved when the concentrations of naphthylacetic acid and 6-benzylaminopurine were 0.20mg/L and 2.0mg/L ， re? spectively. By optimizing antioxidants， plant growth regulators， and culture conditions， the browning phenomenon of large flowered Phalaenopsis explants can be effectively controlled， and the induction efficiency of protocorms can be significantly improved. This study provides theoretical basis and tech? nical support for the efficient tissue culture propagation of large flowered Phalaenopsis.

Key words： large flowered butterfly orchid; explant; browning control; protocorm induction （欄目編輯：董清芝）