從自體廢棄軟骨組織中提取軟骨細(xì)胞的方法探究

DOI：10.16424/j.cnki.cn32-1807/r.2025.05.006

[中圖分類號(hào)]R329.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)] 1674-7887（2025）05-0435-04

Exploration of methods for extracting chondrocytes from autologous discarded cartilage tissue*

XUERunnan1**，YAOWanglin，ZHUWenfeng2**，XIAOChang hao’，GUYuanyang1 （'Department of Orthopedics， AfiliatedHospital6ofNantongUniversityYanchengThirdPeople'sHospital，Jangsu2245;DepartmentofOrtopedis， Affiliated Qidong Hospital of Nantong University）

[Abstract]Objectie：Toinvestigateamethodfor extractingpurechondrocytesfromautologous discarded cartilage tissue. Methods：（1）Anoriginalcartilagecolectiondevicewasused tocolectdiscardedcartilagetissuefromcartilagedefectareas in knee jointcartilageinjurypatientsscheduledforautologouschondrocyte transplantation，folowedbychondrocyteextraction. （2）Cell morphology was observed under inverted phase contrast microscopy to determine conformity with chondrocyte morphology.Toluidineblue staining wasperformed toverify normal chondrocyte staining characteristics.Immunohistochemical staining was used to identify type collagen-secreting chondrocytes.Results： Cartilage mass： 72 mg; cell concentration： 1.736 |×| （20 （20 10⁴ cels/mL.Primary celsappeared spherical，uniformly sized，suspended inculture medium with peripheral refractivity. After48hourculture，celsgrewinpolygonal shapeswithcolony-forming characteristics，consistentwithchondrocytegrowth paterns.Toluidine bluestainingshoweddark bluenuclei，light bluecytoplasm，and clearlyvisible contours，conforming to chondrocyte staining features.Immunohistochemical staining revealedyelow-brownnuclei，brown-yelow extracellularmatrix， andyellow-brownganulesaroundcels，indicating typeIcollagensecretion.Conclusion：Theoriginal“blade-filteraspirator\" deviceenables eficient intraoperative recoveryofdiscarded cartilage.Thestepwiseenzymaticdigestion method sucesfuly extractshigh-puritychondrocytes，providinganovelcell sourceforautologouschondrocytetransplantationtechnologywhile avoiding iatrogenic injury caused by traditional harvesting.

[Key words] cartilage tissue; chondrocyte; cartilage defect; autologous chondrocyte transplantation technology

軟骨是一種結(jié)締組織，由富含膠原蛋白和蛋白多糖的基質(zhì)及單一細(xì)胞類型（軟骨細(xì)胞）組成I。因軟骨缺乏血管和神經(jīng)，僅通過擴(kuò)散獲得營(yíng)養(yǎng)，其損傷后不具備自我修復(fù)能力。軟骨損傷、缺損是膝、踝等大關(guān)節(jié)疼痛的重要原因[3。軟骨損傷目前仍無絕對(duì)的治愈方法。傳統(tǒng)微骨折技術(shù)使用再生的為纖維軟骨，其生物力學(xué)和透明軟骨相差很遠(yuǎn)。自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)較傳統(tǒng)微骨折技術(shù)具有明顯優(yōu)勢(shì)[5-I0]。但這項(xiàng)技術(shù)受限于供體、軟骨缺損面積、易退變等問題。患者自體軟骨組織通常取自膝關(guān)節(jié)的非負(fù)重區(qū)[11-12]，可造成醫(yī)源性損傷，因此該技術(shù)未被廣泛接受，限制了其臨床應(yīng)用。本研究使用自制裝置在對(duì)患者關(guān)節(jié)軟骨損傷部位清理過程中獲取組織，提取軟骨細(xì)胞，為軟骨組織及軟骨細(xì)胞的來源提供一種新的思路。

1材料與方法

1.1一般資料選取在2024年11月23日就診的行關(guān)節(jié)鏡微創(chuàng)下清理、探查的膝關(guān)節(jié)軟骨損傷Ⅲ～V級(jí)患者1例。術(shù)前完善膝關(guān)節(jié)X線檢查、MRI檢查和血液檢查以排除骨性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病和傳染病。

1.2材料與試劑DMEM-F12培養(yǎng)液、胎牛血清（普諾斯）， 0.25% 胰蛋白酶 .0.2% Ⅱ型膠原酶、PBS、臺(tái)盼藍(lán)染液 .1% 甲苯胺藍(lán)染液 .4% 多聚甲醛（LEAGENE）、DMSO（索萊寶）（Biosharp），無水乙醇（北京化工廠），2.5% 戊二醛 .1% 酸（麥克林）。

1.3方法

1.3.1組織的獲取大腿上1/3扎止血帶，全身麻醉成功后，消毒、鋪單，置人關(guān)節(jié)鏡頭，探查關(guān)節(jié)腔，確定關(guān)節(jié)軟骨損傷部位后進(jìn)行關(guān)節(jié)清理。采用一次性使用無菌輸血器（蘇云醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：A1，批號(hào)：20240521）自制刨刀-過濾網(wǎng)-吸引器裝置（圖1）：將輸血器帶氣針的一端沿滴斗上端剪掉，剩余部分連接清理關(guān)節(jié)軟骨的刨刀，末端接吸引器，含雜質(zhì)的軟骨組織被吸人時(shí)軟骨組織即被附著于滴斗里的過濾網(wǎng)上，術(shù)中操作嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則。然后用無菌剪刀分離濾網(wǎng)，分離出滑膜等雜質(zhì)，初步篩選出軟骨組織，將所獲取的組織裝人含PBS、抗生素的無菌 50mL 離心管中。樣本采集符合《赫爾辛基宣言》要求，經(jīng)鹽城市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核（倫理-2024-127）。

圖1自制收集裝置“創(chuàng)刀-過濾網(wǎng)-吸引器”

1.3.2細(xì)胞的提取 （1）用含雙抗（抗青霉素-鏈霉素）的PBS漂洗軟骨組織3次后，留存組織轉(zhuǎn)入 10mL 離心管（1號(hào)管）；（2）1號(hào)管內(nèi)加入和留存組織體積相等的 0.25% 胰蛋白酶，放入振蕩器 37^°C 下 205r/min 震蕩 0.5h ;（3）相等體積含有胎牛血清的培養(yǎng)基即刻加入1號(hào)管終止胰酶消化， 1300r/min 離心 5min ，獲得沉淀的組織；（4）取沉淀組織兩倍體積的 0.2% ⅡI型膠原酶加入1號(hào)管， 37°C 下 205r/min 振蕩消化1h;（5）1 號(hào)管 1300r/min 離心 5min 后，將含細(xì)胞的液體吸入另一 10mL 離心管（2號(hào)管），并加人相等體積含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化；（6）2號(hào)管1800r/min 離心 5min 后，吸管吸除液體獲得沉淀的細(xì)胞;（7）重復(fù)上述4～6步驟5次。

1.3.3細(xì)胞的計(jì)數(shù)與鑒定 （1）將沉淀的細(xì)胞加 10mL 培養(yǎng)基，移液槍均勻吹打后取2滴液體采用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)；（2）觀察細(xì)胞的大體形態(tài)，培養(yǎng) ^48h 后觀察貼壁后的細(xì)胞形態(tài)；（3）甲苯胺藍(lán)染色鑒定：將1/3細(xì)胞放入含蓋玻片的培養(yǎng)皿中培養(yǎng) ^48h ，用不含抗生素的PBS緩慢沖洗2次，并用 4% 多聚甲醛溶液固定 20min?0.1% 甲苯胺藍(lán)染液浸泡 2h 后再用 90% 無水乙醇沖洗[13-14]，鏡下觀察；（4）Ⅱ型膠原免疫組化染色鑒定：室溫下用 3% 過氧化氫溶液孵育細(xì)胞 10min ，PBS沖洗2次，后加入血清，孵育10min ，去除血清后加入一抗（兔抗人Ⅱ型膠原），4^°C 過夜;PBS沖洗，加入二抗孵育 10min 后DAB顯色，以蘇木精染液復(fù)色，無水乙醇脫水后封片，鏡下觀察[]。

2結(jié)果

2.1軟骨細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)患者軟骨質(zhì)量為 72mg 細(xì)胞濃度約 1.736×10⁴ 個(gè) /mL 。

2.2原代軟骨細(xì)胞原代細(xì)胞呈球形，大小均一，懸浮于培養(yǎng)基中，周邊具有一定的折光性（圖2A）。培養(yǎng) ^48h 后，細(xì)胞呈多角形生長(zhǎng)，并表現(xiàn)出集落生長(zhǎng)特性，符合軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)（圖2B）。

2.3細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色鑒定細(xì)胞貼壁后用甲苯胺藍(lán)染色，結(jié)果顯示細(xì)胞核呈深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)顏色較淡，細(xì)胞輪廓清晰可見，符合軟骨細(xì)胞染色特征（圖2C）。

2.4Ⅱ型膠原免疫組化染色鑒定細(xì)胞貼壁后行Ⅱ型膠原免疫組化染色，細(xì)胞核呈黃褐色，細(xì)胞基質(zhì)呈棕黃色，黃褐色顆粒在細(xì)胞周圍出現(xiàn)，提示該細(xì)胞能分泌Ⅱ型膠原（圖2D）。

圖2原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)

注：A，剛提取的原代細(xì)胞形態(tài)；B，培養(yǎng) ^48h 后原代細(xì)胞形態(tài)； C，細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色；D，Ⅱ型膠原免疫組化染色。a，細(xì)胞核； b，細(xì)胞基質(zhì)。A ，Bar=100μm ;B～D， Bar=50μm 0

3討論

隨著膝關(guān)節(jié)軟骨損傷人數(shù)的不斷增多，臨床出現(xiàn)了有望治愈軟骨損傷的自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)，13]。但自體軟骨組織的來源成為科研道路絆腳石。目前軟骨細(xì)胞多為動(dòng)物來源[14-15]，對(duì)人體的適用性和兼容性尚不明確。本研究探索利用自制裝置從自體軟骨損傷區(qū)獲取軟骨組織，并提取軟骨細(xì)胞，從而解決自體軟骨的來源問題。本研究成功應(yīng)用了自制的“刨刀-過濾網(wǎng)-吸引器”一體化裝置進(jìn)行術(shù)中軟骨組織的收集。該方法的核心優(yōu)勢(shì)在于高效、安全地回收了原本可能被廢棄的軟骨組織，為后續(xù)高質(zhì)量的軟骨細(xì)胞提取奠定了關(guān)鍵基礎(chǔ)。相較于傳統(tǒng)術(shù)中直接丟棄或繁瑣的單獨(dú)收集方式，該裝置的集成設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了術(shù)中操作與組織回收的同步化。其內(nèi)置濾網(wǎng)有效攔截并富集了刨削產(chǎn)生的軟骨碎片，顯著減少了組織損失，提高了可用于細(xì)胞提取的軟骨總量。同時(shí)，利用一次性無菌輸血器組件并嚴(yán)格遵循無菌操作原則，最大程度地保障了收集過程的無菌性，有效降低了后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)的污染風(fēng)險(xiǎn)。初步富集后的組織也簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)室端的篩選流程。這種簡(jiǎn)便、高效且安全的收集策略，是本研究能夠順利獲取足量、合格軟骨細(xì)胞樣本的重要環(huán)節(jié)，對(duì)于提高關(guān)節(jié)鏡下軟骨細(xì)胞移植等技術(shù)的效率和成功率具有實(shí)用價(jià)值。這種收集方法安全方便，軟骨組織損失少，極大程度地保證后續(xù)軟骨細(xì)胞的順利提取。

本研究獲取的軟骨組織源于關(guān)節(jié)鏡下軟骨損傷區(qū)的清理術(shù)，并非純凈的透明軟骨組織，常混雜脂肪組織、滑膜組織等雜質(zhì)。鑒于雜質(zhì)細(xì)胞活力較低，本研究采用優(yōu)化的階梯酶消化策略以最大限度保護(hù)目標(biāo)軟骨細(xì)胞并提高純度：首先應(yīng)用低濃度胰蛋白酶（0.25%） 進(jìn)行短時(shí) （0.5h） 消化，旨在特異性清除混雜的軟組織雜質(zhì)，同時(shí)將酶對(duì)軟骨細(xì)胞的潛在損傷降至最低；隨后，采用 0.2%I 型膠原酶進(jìn)行5次 ?1h/ 次的重復(fù)消化，以溫和、可控地分解軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)（主要成分為Ⅱ型膠原），逐步釋放軟骨細(xì)胞。此分步、低濃度、短時(shí)程的酶處理方案，顯著區(qū)別于常規(guī)體外實(shí)驗(yàn)報(bào)道的從動(dòng)物軟骨直接使用Ⅱ型膠原酶持續(xù)消化 6～8h^[11-12] 。核心優(yōu)勢(shì)在于：通過嚴(yán)格控制酶種類、濃度及作用時(shí)間，特別是胰蛋白酶的預(yù)處理步驟，有效規(guī)避了酶對(duì)珍貴且有限的臨床廢棄樣本中軟骨細(xì)胞的過度損傷，從而成功實(shí)現(xiàn)了從混雜、微量組織中高效分離高純度、高活性軟骨細(xì)胞。通過觀察，所提取的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)及生長(zhǎng)特性上均符合軟骨細(xì)胞特征：呈聚集生長(zhǎng)的多角形細(xì)胞。正常軟骨細(xì)胞外基質(zhì)富含糖胺聚糖，該物質(zhì)為酸性黏多糖（而非堿性糖聚合物）。甲苯胺藍(lán)染液可與糖胺聚糖中的酸性基團(tuán)結(jié)合而顯色，因此本研究采用甲苯胺藍(lán)染色法對(duì)所獲細(xì)胞進(jìn)行鑒定。同時(shí)，鑒于軟骨組織主要由軟骨細(xì)胞及其特異性表達(dá)的Ⅱ型膠原構(gòu)成，進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)法對(duì)Ⅱ型膠原進(jìn)行染色結(jié)果表明該細(xì)胞具有分泌Ⅱ型膠原的能力。綜上，通過甲苯胺藍(lán)染色與Ⅱ型膠原免疫組化染色兩種方法鑒定，確認(rèn)所獲得的細(xì)胞為純凈的軟骨細(xì)胞。

本研究成功建立了一種從關(guān)節(jié)鏡下廢棄軟骨組織中高效提取高純度軟骨細(xì)胞的方法體系。其核心創(chuàng)新在于：自主研發(fā)的“刨刀-過濾網(wǎng)-吸引器”一體化裝置實(shí)現(xiàn)了術(shù)中軟骨碎片的同步無菌化回收，顯著減少組織損失并規(guī)避傳統(tǒng)取材的醫(yī)源性損傷；同時(shí)，針對(duì)混雜組織特性設(shè)計(jì)的階梯酶消化策略通過精準(zhǔn)控制酶作用強(qiáng)度與時(shí)長(zhǎng)，在清除脂肪、滑膜等雜質(zhì)的同時(shí)最大限度保護(hù)軟骨細(xì)胞活性，最終獲得高純度、高活性的功能性軟骨細(xì)胞。該方法為自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)提供了新型細(xì)胞來源，具有重要臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。

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[收稿日期]2024-12-04