基于網絡藥理學與表面等離子體共振的方法探討巴戟天根治療骨質疏松癥的作用機制

[中圖分類號]R580 [文獻標志碼]A [文章編號] 1674-7887（2025）05-0448-08

Exploring theactionmechanismof Morinda officinalis Radix in treating osteoporosis based on network pharmacology and surface plasmon resonance*

LILiangl**，YANGWeihang2，XUJiahao1，XIAShuangl，JIHongjian3，SHIFengchaol*** （Department of Orthopedics，the SixthAfilatedHospitalofantongUniversityYanchenghirdPeople'sHospital，iangsu224Ool；Orthopediceatet Center，Tongling Municipal People'sHospital; School of Pharmacy，Jiangsu Medical College）

[Abstract]Objectie：Basedonthenetwork pharmacologyandsurface plasmonresonance technology，theactiveingredients andtargetsofMorindaoficinalisRadix（MOR）inthetreatmentofosteoporosis（OP）wereexplored.Methods：TobetterunderstandthemechanismsandtargetsofMOR，anintegratedanalyticalplatformwasbuiltbasedonnetworkpharmacologyncluding targetprediction，protein-proteininteractionnetwork，topologyanalysis，geneenrichmentanalysis，moleculardockingand surfaceplasmonresonance.Results：Usingthisplatform，weidentifiedkeychemicalconstituents inMOR，suchasathraquinone compounds，eta-sitosterol，dibutylphthalate，andoleicacid，thatexhibitanti-OPactivity.Theprotein-proteininteraction network showsthat thecorechemical components exertanti-OP efects through theestrogen signaling pathway，endocrine resistance，andfocal adhesion signaling pathway byacting oncertain targets.Theresults of molecular docking and surface plasmonresonanceindicatethatthereisagoodafinitybetweenthecorechemicalcomponentsandthekeytargets.Conclusion：thecorecomponentsofMOR，namelyanthraquinone-typecompounds，mayexertanti-OPefectsbymodulatingessetial target proteinssuchas SRC，EGFR，JUN，and BCL2 through various signaling pathways，including the estrogensignaling pathway，endocrine resistance，and focal adhesion.

[Keywords]osteoporosis;MorindaoficinalisRadix;networkpharmacology;moleculardocking;sufaceplasmonresonance; signaling pathway

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一種與性別和年齡相關的疾病。以骨量減少和骨結構破壞為特征，最終導致骨強度受損和骨折風險增加[1-2]。目前，OP的藥物治療主要通過兩種機制途徑，分別是抑制骨吸收和促進新骨的代謝合成。然而，長期使用這些藥物可導致骨折風險如下頜骨壞死等不良反應[3-4。

巴戟天根（Morinda officinalis Radix，MOR）是茜草科植物的干燥根。據《中國藥典》（2020年版）記載，具有“補腎陽，強筋骨，祛風濕\"等功能。既往研究表明，MOR可用于緩解多種疾病，包括陽痿、風濕性關節炎和骨質疏松癥等。然而，MOR能否用于治療OP的骨丟失及具體作用機制尚不清楚，有待進一步闡明。網絡藥理學“多靶點、多通路\"的特點與中藥復方成分多途徑、多機制綜合治療疾病的特點相似6-，在研究中藥潛在的作用機制方面表現出優越的性能8。目前，國內基于網絡藥理學預測MOR的活性成分和作用靶點的報道較少，篩選出的靶點缺乏相應的實驗驗證。本研究旨在利用網絡藥理學和分子對接技術，建立MOR抗OP“成分-靶點\"相關性，并采用表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）技術對關鍵成分和靶點相互關系進行驗證，探討MOR抗OP的作用機制，為后續研究提供參考。

1材料和方法

1.1材料2-甲基蒽醌和 β -谷甾醇購自上海詩丹德標準技術服務有限公司。UM-164購自美西埃克斯（上海）生物科技有限公司。3種小分子物質均保存于 0～8°C. 。重組人SRC蛋白購自徐州華瑞生物技術有限公司， -20^°C 保存。

1.2藥物活性成分及相應的靶點選取傳統中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TraditionalChineseMedicineSystemsPharmacologyDatabaseand Analy-sis Platform， TCMSP，https： //tcmspw.com/tcmsp.php），輸人MorindaeOfficinalisRadix，將篩選條件設置為口服生物利用度（oral bioavailability， 0%% ，類藥性（drug-likeness，DL） ?0.1 ，獲得MOR的藥物成分9]。同時結合 SwissTargetPrediction（htp：//swisstar-getprediction.ch/）網站獲取上述成分的對應靶點[1%]。

最后用通用蛋白質資源（Universal Protein Resource，UniProt）數據庫（http：//www.uniprot.org/）對作用靶點進行規范，剔除重復，構建MOR藥物成分-靶點-基因數據庫。

1.3獲取OP疾病靶點在Genecards（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）與CTD（https：//ngdc.cncb.ac.cn/databasecom-mons/database/id/754）等數據庫中輸人“osteoporosis”，設置物種為“homo sapiens”，刪除重復項，構建OP疾病相關的基因數據庫。將經uniprot數據庫轉換好的藥物靶點基因及OP疾病相關的基因輸入Venny（https：//bioin-fogp.cnb.csic.es/tools/venny/），以獲取二者之間的交集基因，構建MOR成分靶點與OP疾病靶點的交集基因數據庫。

1.4治療作用靶點蛋白-蛋白相互作用（protein-proteininteraction，PPI網絡構建與關鍵靶點、核心靶點篩選在PPI網絡中，節點代表蛋白質，各節點之間的連線代表具有相互作用，節點的大小、顏色、連接長度和厚度代表節點網絡的拓撲參數。將MOR成分與OP疾病對應的交集基因輸入STRING12.0數據庫（htps：//cn.string-db.org/），設置物種為“homosapiens”，最低交互得分設定為0.9，刪除沒有相互作用的節點，構建出PPI網絡關系圖，節點的連線數目越多，則越有可能被選定為核心基因。

將PPI網絡拓撲圖數據導人cytoscapev3.10.2軟件，使用cytoHubba插件基于節點度數（Degree）、緊密度（Closeness）、介數中心性（Betweenness）、瓶頸性（BottleNeck）、中心性（EcCentricity）和最大團中心性（maximalcliquecentrality，MCC）方法鑒定MOR-OP的PPI網絡中的關鍵基因，并繪制Venny圖。使用分子復合物檢測（molecular complex detection，MCODE）插件識別節點基因之間顯著富集的網絡簇，度截止值、節點得分截止值和K-Core值分別設置為2、0.2和2，將MCODE得分 ?3 的網絡簇篩選為顯著富集基因簇。

1.5GO與KEGG信號通路富集分析將此前獲得的MOR成分與OP疾病的治療作用靶點導入生物信息注釋數據庫（Database forAnnotation，VisualizationandIntegratedDiscovery，DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/），設置物種為\"homo sapiens”，進行GO 富集分析和KEGG通路富集分析，篩選出生物過程（biologicalprocess，BP）細胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）以及KEGG 富集分析結果的前20位做直方圖和氣泡圖。

1.6藥物成分-交集基因-信號通路網絡拓撲圖的可視化構建藥物成分-交集基因-信號通路數據庫，將數據導人cytoscape v3.10.2Ω 軟件，繪制\"藥物成分-交集基因-信號通路”的三元網絡。

1.7核心成分-核心靶點分子對接驗證使用cytos-cape v3.10.2Ω 中的插件cytoHubba 基于 Degree、Clo-seness、Betweenness、BottleNeck、EcCentricity和MCC方法選定MOR治療OP過程中的核心基因，在蛋白質數據庫（https：//www.rcsb.org/）中獲取活性成分、靶點蛋白的3D結構，在pymol軟件中去除靶點蛋白中的水分子和原始配體后，導人AutodockToolsv1.5.7軟件加氫后選定為受體。根據藥物成分-交集基因-信號通路網絡中節點連線數目的多少等拓撲特性篩選出可能發揮主要作用的藥物成分，并通過TCMSP數據庫下載藥物成分的三維結構，將之選定為配體。用Autodock4.2軟件進行分子對接驗證，同時計算蛋白質受體與小分子配體間的自由能，以評估二者間的結合能力，自由能越小，說明受體與配體的結合能力越好。將自由能最小的對接結果選為最佳結合模型，最后通過Pymol對結合模型進行可視化。

1.8SPR 實驗

1.8.1芯片預處理使用BiacoreTMInsight Evalua-tionSoftware4.0開展SPR實驗，設置系統溫度 25^°C 用HBS-EP緩沖液沖洗管道，流速為 10μL/min ，待沖洗完成后，持續用HBS-EP緩沖液平衡系統，直至基線達到穩定狀態，然后對CM5芯片表面進行預處理。用 1×PBS 稀釋SRC蛋白原液并置換buffer去除ATP后，用 pH 為 4.5，5.0，5.5 時的乙酸溶液稀釋靶標蛋白，根據 pH scouting的結果（圖1），pH為5.5時信號較低， pH5.0 和 pH4.5 相差不大，所以選擇更接近中性的 pH5.0 ，質量濃度 10μg/mL 。

圖1SRC蛋白pH scouting結果

1.8.2 蛋白固定 運行試劑為 pH7.4 的 1×PBS 溶液，芯片活化 420s ，配體耦聯約 1200s ，使蛋白固定量盡量高，芯片封閉 420s ，完成配體固定，首先耦聯1個通道，并指定這個通道為樣品通道，且每個實驗均包含1個沒有蛋白質的空白通道，利用樣品通道的響應值減去空白通道的響應值，以糾正體積折射率變化和非特異性結合。

1.8.3動力學分析為確保研究結果的可靠性，對不同濃度的 UM-164（0.05?0.025?0.012 5?0.006 25? 0.003125μmol/L） 與該蛋白的相互作用進行了多循環動力學分析。參數：結合時間 60s ，分離時間 150s ，運行使用 1×PBSpH7.40.05% Tween -205% DMSO緩沖液。驗證成功，同時驗證了SRC蛋白的活性。在此基礎上，根據預實驗方法耦聯2個通道進行另外兩個樣品的測試。2個待測樣品的濃度分別為200、100.50，25.6.25μmol/L 。親和力曲線使用該軟件進行評估及擬合。繪制單體化合物與靶蛋白的結合曲線，即SPR光譜圖，并計算獲得動力學參數（Ka）、解離速率常數（Kd）和解離平衡常數 τ（KD） 。

2結果

2.1MOR的活性成分從TCMSP數據庫中檢索到MOR的化學成分共有174種[12]，獲得符合條件的MOR化學成分39種。通過TCMSP與SwissTarget-Prediction數據庫獲取對應靶點，最終獲得對應靶點共計491個，刪去重復項后，得到MOR中39種化學成分對應241個靶標。

2.2OP相關基因在Genecards、DisGeNET與CTD等數據庫中以“osteoporosis\"為檢索詞搜索與OP相關的人類物種基因，分別搜索到 1408.1822.2482 個相關基因，合并以上數據庫結果并去除重復項后，共獲得3413個與OP疾病相關的基因（圖2A）。

2.3共同靶點MOR和OP的重疊靶點可認為是MOR治療OP的潛在靶點。根據交叉分析，最終獲得151個與OP疾病有關的MOR活性成分靶點用于后續分析。

2.4蛋白質相互作用將此前獲得的151個共同靶點導人STRING12.0數據庫進行分析，刪除無相互作用的44個節點后，獲得PPI網絡拓撲圖（圖2B）。結果顯示，PPI網絡圖中包括107個節點，220條邊，平均節點度值為4.11。其中，Degree值排序前5的節點為：STAT3、BCL2、SRC、BCL2L1和EGFR，分別為：17、16、15、14、13。將數據導人cytoscape v3.10.2Ω 軟件進行可視化（圖2C），節點越大，顏色越紅，代表Degree值越大，反之節點越小，顏色越黃，代表Degree值越小。同時，MCODE分析顯示有3個中心基因簇得分 gt;3 分（圖2D）。為識別MOR-OP相關的核心基因，利用cytoHubba插件，基于Degree、Close-ness、Betweenness、BottleNeck、EcCentricity和 MCC6種拓撲算法對PPI網絡進行分析。結果鑒定出SRC、EGFR、JUN、STAT3和BCL2等關鍵基因，其對應蛋白被認為是網絡中的核心節點（圖2E），這些基因在2個中心基因簇中出現，因此認為其可能是MOR-OP的PPI網絡中的關鍵基因。

圖2OP靶點、MOR-OP共同靶點PPI網絡及交集靶點

注：A，OP相關靶點韋恩圖;B～C，MOR與OP共同靶點的PPI網絡拓撲圖;D，節點代表不同的靶蛋白，節點之間的連線代表不同靶蛋白之間的相互作用;E，不同顏色的區域代表通過不同方法在MOR-OPPPI網絡中篩選的前20種靶蛋白。

2.5GO功能注釋和KEGG富集分析對151個MOR和OP交集靶基因進行GO功能注釋和KEGG富集分析，結果顯示在BP、CC和MF中分別富集了1655條、107條、156條，BP、CC和MM的前20個項目見圖3A～C。

KEGG富集分析獲得了179條。本研究旨在闡述MOR在治療OP中的應用，因此主要關注與OP相關的信號通路，KEGG富集分析結果中前20個非癌癥通路的氣泡圖（圖3D），表明MOR治療OP的主要生物學通路可能有：EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、HIF-1信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、乙型肝炎、細胞凋亡等信號通路。2.6MOR活性成分-交集靶基因-KEGG信號通路網絡圖利用cytoscapev3.10.2軟件構建MOR活性成分、151個交集基因及前20個關鍵KEGG信號通路網絡圖（圖4）。由網絡圖譜分析獲得MOR的8個最相關的核心成分：2-羥基-3-甲基蒽醌、2-羥基蒽醌、1-羥基-3-甲氧基-9，10-蒽醌、2-甲基蒽醌 ?β- 谷甾醇、茜草素、鄰苯二甲酸二丁酯、油酸。

2.7分子對接基于上述分析結果，將 _SRC，EGFR ！JUNBCL2作為MOR治療OP中的核心靶點，并與MOR的8個核心成分分別進行對接，通過計算配體與受體之間的自由能（圖5），評估二者間的結合能力，自由能越小，說明受體與配體的結合能力越好，對接結果顯示，SRC蛋白分別與2-甲基蒽醌和β-谷甾醇對接的自由能分別為 和 MOR中的蒽醌類化合物與核心靶點的對接均顯示出良好的結合性，說明蒽醌類化合物是MOR治療OP的重要活性成分（圖6）。

圖3MOR-OP共同靶點的GO功能注釋和KEGG富集分析氣泡圖（前20）

圖4MOR活性成分-交集靶基因-KEGG信號通路網絡圖

圖5MOR核心成分與關鍵靶點分子對接熱圖

注：顏色代表MOR核心成分與關鍵靶點對接的自由能大小，越藍說明自由能越小，結合能力越好；越黃說明自由能越大，結合能力越差。單位：kJ/mol。

2.82-甲基蒽醌和 β- 谷甾醇均能與重組人SRC蛋白相互作用U.NDAGI等[3利用SPR分析SRC蛋白UM-164的結合模式，結果顯示SPR在闡明小分子物質與SRC蛋白相互作用方面具有明顯的實用性，故對其進行了驗證，結果顯示，SRC的KD值為3.71×10^-9 mol/L（圖7A、表1）。本研究還使用SPR分別分析了SRC蛋白與2-甲基蒽醌（圖7B）和 β -谷甾醇（圖7C）的相互作用機制，結果顯示2-甲基蒽醌和β -谷甾醇均可與SRC蛋白結合并相互作用。2-甲基蒽醌在濃度分別為 100mmol/L 和 200μmol/L 時的曲線上有較小的異常峰，懷疑這是由于它在DMSO溶液中溶解度不足，導致一些小分子物質聚集引起的。

3討論

OP是一種與多種因素相關的疾病，隨著全球社會老齡化進程，OP已經成為世界上最常見的慢性疾病之一[4。在50歲以上的人群中，女性OP的發病率為 33.33% ，男性為 20% [15]，絕經后女性由于缺乏雌注：A，UM-164與SRC蛋白結合親和力的SPR分析;B，2-甲基蒽醌與SRC蛋白結合親和力的SPR分析;C，β-谷甾醇與SRC蛋白結合親和力的SPR分析。

注：A，BCL2蛋白；B，EGFR蛋白；C，JUN蛋白；D，SRC蛋白。

圖62-羥基-3-甲基蒽醌與關鍵靶點分子對接圖

激素加之年齡相關的DNA損傷會抑制骨細胞生成，因此也更易患 OP^[16] 。近年來一些研究[17-18表明OP在老年男性群體中的危害同樣不容忽視。目前常用的一些治療OP的藥物常伴有一系列不良反應，在一定程度上限制了這些藥物的使用[1]。為探索MOR治療OP的分子機制，本研究利用網絡藥理學和SPR技術，從微觀層面上進行了探索，并為其治療OP提供了理論依據。

通過對MOR中化學成分的藥代動力學分析，確定了39種活性成分和151個OP相關的潛在靶點，KEGG分析表明，這些靶點主要富集在與癌癥相關的通路中，這可能與MOR通過多組分、多靶點、多機制發揮抗OP作用有關，如Ca2+/鈣敏感受體信號傳導受損或miRNA失調可能導致骨形成不足、腫瘤進展，引起OP 和癌癥的發生[2%。此外，基于 MCODE 和cyto-Hubba對這些潛在靶點的PPI網絡進一步分析，獲得了5個核心蛋白（SRC、EGFR、JUN、STAT3、BCL2）可能與MOR治療OP密切相關的靶基因，其中的4個蛋白（SRC、EGFR、JUN、BCL2）富集在雌激素信號通路、內分泌抵抗、焦點黏附信號通路中。F.J.DEPAULA等2通過闡述胰島素抵抗導致鈣磷代謝紊亂說明了代謝疾病與OP的關系，H.GUO等[22研究也表明高水平的胰島素抵抗抑制骨轉換標志物的形成進而導致OP的發生。此外，乳腺癌的內分泌治療通常涉及阻斷雌激素信號通路，這可能導致內分泌抵抗，而雌激素水平降低是OP的重要危險因素[23]。

圖73種物質分別與SRC蛋白結合親和力的SPR分析

表13種物質分別通過SPR實驗得到的 Ka，Kd 和KD值

蒽醌類化合物是MOR中的主要化學成分之一，所有的蒽醌衍生物在其核心結構上都至少具有1個羥基或甲氧基取代基，且僅1個含碳側鏈[24。L.L.BAO等25通過對絕經后小鼠的體外試驗表明，蒽醌類化合物可以通過抑制破骨細胞的骨吸收發揮抗OP的作用，與Y.B.WU等[24，2o的結論一致。此外，β-谷甾醇、鄰苯二甲酸二丁酯、油酸也可以通過調控破骨細胞或成骨細胞發揮良好的抗OP活性[27-28]。說明上述成分可能是MOR發揮抗OP作用的核心化學成分。

本研究中，獲得了4個MOR治療OP的潛在靶點。RANKL可以誘導 c-SRC 以 α_α，β3 介導細胞外基質啟動破骨細胞依賴的方式結合RANK，從而激活破骨細胞[2]，一項SRC敲除后的動物實驗[30表明，高活性的SRC對破骨細胞的骨吸收作用至關重要，此外，SRC 還抑制Runx2的活性，Runx2是成骨細胞分化的主要調節因子，可抑制成骨細胞中的骨形成，這些證據似乎也說明了黏附相關信號通路在MOR治療OP的過程中發揮了重要作用。JUN是一種轉錄因子，F.IKEDA等β報道了JUN信號傳導對RANKL調節破骨細胞分化至關重要。Z.Z.MA等2研究也說明了缺氧狀態下可以通過干擾JNK抑制RANKL誘導的破骨細胞形成。有趣的是，兩項研究都提到了活化T細胞核因子1（nuclear factor of activated T-cells1，NFATc1）和抗酒石酸鹽酸性磷酸酶（tartrate-resis-tantacidphosphatase，TRAP）具有促進破骨細胞分化的作用，說明JUN抑制RANKL是通過抑制NFATc1和（或）TRAP介導的。EGFR屬于ErbB受體酪氨酸激酶家族，早期研究[33表明，EGFR信號傳導參與破骨細胞的形成，且對于骨髓前體細胞形成破骨細胞是必須的。最近，M.LINDER等[34指出這一現象可能與EGFR/ERK/IGFBP-3信號通過抑制IGF-1R/mTOR通路來調控成骨細胞的成熟有關，EGFR缺陷引起骨質減少，并表現出軟骨內和膜內骨化受損，導致骨骼礦化不規則，發生OP。BCL2是發育、分化和疾病中細胞凋亡的重要調節因子，研究35發現BCL2可影響破骨細胞的存活，說明BCL2可能通過控制成骨細胞和（或）破骨細胞的壽命和功能調節骨骼生長。

MOR活性成分與靶蛋白的分子對接結果顯示具有良好的對接活性，提示這些活性成分和靶點可能是OP治療的核心成分和關鍵靶點。SPR實驗的結果也證實了2-甲基蒽醌和 β -谷甾醇對SRC蛋白的靶向作用。此外，2-甲基蒽醌與SRC蛋白相互作用的KD值更小，說明2-甲基蒽醌與SRC蛋白的結合更為穩定。然而，也有一些缺陷。例如，本文只對一種蒽醌物質與一種靶點之間的相互作用進行了SPR實驗。今后還需要對各種蒽醌類物質與其他靶點進行更多的SPR實驗，以進行驗證。另外本研究只進行了體外實驗，未來也需要進行體內實驗來驗證其余活性成分和其他靶蛋白之間的相互作用。

綜上，本研究利用網絡藥理學聯合SPR技術的方法，篩選出MOR治療OP的主要作用成分是蒽醌類化合物。它們通過雌激素信號通路、內分泌抵抗、焦點黏附等信號通路，靶向調控SRC、EGFR、JUN、BCL2等核心基因，發揮抗OP作用。

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