膿毒癥相關長鏈非編碼RNA篩選及競爭性內源RNA網絡構建

[中圖分類號]R631 [文獻標志碼]A [DOI] 10.19767/j.cnki.32-1412.2025.05.002

Screening of Sepsis-Associated Circular RNAs and Construction of Competing Endogenous RNA Networks

GUANYuwen，LIANGGuiwen，HUANG Zhongwei，QI Lei， JIANGHaiyan （Departmentof EmergencyMedicine，Afliated Hospital of Nantong University，Jiangsu 226001）

[Abstract]Objective：To explore the regulatoryroleof non-coding RNAs（ncRNAs），particularlylong non-coding RNAs （lncRNAs），inthepathological progressionofsepsis，toidentifynvelbiomarkersforarlydiagnosis，andtoiscover potential therapeutic targets for intervening in immune imbalance.Methods：Peripheral blood samples frompatients with sepsisand healthy individualswerecollected.Wesystematicallyanalyzed the specific expression profilesof lncRNAs in sepsis through ceRNA microarray technology. We investigatedtheregulatory mechanisms oflncRNAs insepsis byintegating theinteractionnetworksof microRNAs（miRNAs）and circularRNAs（circRNAs）.Results：The studyrevealed that IncRNAsexhibitedsignificant diferential expresion insepsis，including248up-regulatedand26down-regulated lncRNAs withdiferential expression.CombiningGOenrichmentanalysisandKEGGpathwayclasificationanalysis，theesults indicatedthat lncRNAsmightparticipate intheregulationof inflammatorystormsand immunosuppressonthrough the ceRNA mechanism.Certain IncRNAs were closely asociated with immune imbalance in sepsis，demonstrating potential as biomarkers or therapeutic targets.Conclusion：lncRNAsplayacriticalrole inthepathological progresionofsepsis.Their specific expresionprofilesprovidenovelcandidate biomarkers forearlydiagnosisof sepsisandoferpotentialtargets for therapeutic strategies aimed at modulating immune dysregulation.

[Keywords] sepsis; non-coding RNA;biomarker

膿毒癥（Sepsis）是由于宿主對感染的反應失調，引起危及生命的器官功能障礙I。根據《拯救膿毒癥運動》（Surviving Sepsis Campaign，SSC）最新指南，膿毒癥需早期診斷和治療以改善預后并降低死亡率2。然而，自前仍缺乏早期識別膿毒癥的生物標志物及針對性治療手段，因此，深入探索膿毒癥的發病機制至關重要。膿毒癥可誘發心血管功能障礙、急性肺損傷（acute lung injury，ALI）急性腎損傷（acute kidneyinjury，AKI）等器官功能障礙，導致高死亡率3，亟需進一步研究膿毒癥誘發器官功能障礙的病理生理機制?；蛘{控網絡研究長期集中于蛋白質編碼基因，然而人類基因組中約 90% 非編碼序列可轉錄為非編碼RNA（ncRNA），ncRNA在多種生物過程中發揮關鍵調控作用。ncRNA可分為短鏈ncRNA（ lt;200 個核苷酸）和長鏈ncRNA（IncRNA， gt;200 個核苷酸）。短鏈ncRNA以微小RNA（miRNA）為主，miRNA參與膿毒癥等多種疾病[8。但對占ncRNA大部分的IncRNA研究仍處于起步階段。

研究發現，lncRNA對膿毒癥器官功能損傷有重要作用，同時lncRNA通過調控核因子 -κB （NF-kF）、NLRP3等信號通路影響炎癥因子釋放。盡管lncRNA不編碼蛋白質，但在基因表達的調控中發揮重要作用，可能構成膿毒癥關鍵的內源競爭RNA（competingendogenousRNA，ceRNA）調控網絡。根據與鄰近蛋白質編碼基因組的位置關系，lncRNA可分為基因間型、內含子型、雙向型、正義型、反義型和增強子型lncRNA]。按調控模式，IncRNA可分為順式作用（影響鄰近基因的表達和/或染色質狀態）和反式作用（在細胞內執行多種功能）兩類[2]。lncRNA通過直接結合DNA、RNA及蛋白質參與轉錄和轉錄后調控[13]。在靶基因的轉錄調控中，lncRNA可作為支架或誘餌抑制或激活基因[o]。此外，lncRNA還能增強基因轉錄，并通過改變mRNA剪接實現共轉錄調控。lncRNA可影響mRNA穩定性，并通過結合核糖體或mRNA調控翻譯過程[14。lncRNA還能作為miRNA海綿，間接解除miRNA對靶mRNA的抑制[15]。這些證據表明，IncRNA是一類龐大、多樣且重要的轉錄本，通過多種機制參與基因表達調控。本文旨在為lncRNA在膿毒癥中的作用機制提供新的分子視角，為膿毒癥的早期診治提供新的方向。

1資料與方法

1.1研究對象選取2024年5月一9月在我院重癥監護室確診的3例膿毒癥患者為研究對象，按指南進行規范治療。納入標準：（1）年齡：18～70歲；（2）符合2016年美國危重病醫學會（SocietyofCriticalCareMedicine，SCCM）聯合歐洲危重病醫學會（Eu-ropeanSocietyofIntensiveCareMedicine，ESICM）有關膿毒癥診斷標準。排除標準：（1）既往有腫瘤、血液系統疾病、免疫風濕性疾病史者；（2）合并重癥急性胰腺炎；（3）2周內使用過糖皮質激素。以3例健康者作為對照，采樣前后2周未患任何疾病。本研究方案獲得醫院倫理委員會批準，患者或家屬簽署知情同意書。

1.2 實驗室檢測

1.2.1RNA抽提：采集研究對象靜脈血 2～5mL 于抗凝管，快速轉移至RNase-free凍存管中， -80^°C 冰箱保存。采用PAXgeneTM血液RNA試劑盒（Cat#762174，Qiagen，Germany），按照廠商提供的標準操作流程抽提樣品總RNA，經生物分析儀2100（AgilentTechnologies，US）電泳質檢合格后備用。

1.2.2RNA放大和標記：采用表達譜芯片配套試劑盒（Cat.#5190-2305，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，US）對樣品總RNA進行放大和標記，并用RNeasymini kit（Cat.#74106，QIAGEN，GmBH，Germany）純化標記后的cRNA。

1.2.3芯片雜交：采用表達譜芯片配套試劑盒（Cat.#5188-5242，AgilentTechnologies，US），在滾動雜交爐（Cat.#G2545A，Agilent Technologies，US）中 65^°C， 10r/min 滾動雜交 ^17h ，雜交cRNA上樣量 1.65μg 并在洗缸（Cat.#121，Thermo Shandon，US）中洗片。

1.2.4芯片掃描：完成雜交的芯片采用芯片掃描儀（Cat.#G2565CA，Agilent Technologies，US）掃描，軟件設置染料通道為綠色，掃描分辨率365CA。用特征提取軟件10.7（Agilent Technologies，US）讀取數據，最后采用R軟件中limma包進行歸一化處理，所用的算法為分位數Quantile。

1.3差異表達基因篩選在初步差異分析的基礎上，我們進行補充分析以提升結果的穩健性。通過主成分分析剔除個體差異過大的離群樣本，以降低組內異質性。調整樣本分組策略，在差異基因篩選階段，同步采用差異倍數閾值，引入配對 χ_t 檢驗計算 P 值，利用 P 值與 log2FC 的組合標準進行雙重篩選。1.4差異基因圖形分析由于差異基因篩選條件的改變，所篩選出的差異基因也會有所變化?？蓪π潞Y選的差異基因進行散點圖、火山圖、熱圖分析。由于樣本分組信息改變，需要更新樣本相關性分布圖時，可進行主成份分析、樣本相關性分析、樣本聚類分析。

1.5差異基因的基因功能分析（Gene Ontology，GO）、信號通路分析（pathway）GO富集分析采取luster-Profiler軟件包，挑選的標準是落在某個 上差異的基因數目 ?2，Plt;0.05 ，圖中 按照富集因子的值從大到小降序排列，取前30個結果。富集因子定義 Σ=Σ （某個 term 中的差異基因數目/總的差異基因數目）八數據庫 term 中總的基因數目/數據庫中總的基因數目）。由于差異基因篩選條件的改變，選出的差異基因也會有所變化。采用DAVID6.8數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對差異表達基因進行KEGG功能富集與GO功能富集分析。

1.6測序數據質量控制由于原始測序數據中會包含測序接頭序列、低質量讀段、N率較高序列及長度過短序列，嚴重影響后續組裝的質量。為保證生物信息分析的準確性，需對原始測序數據進行過濾，以得到高質量的測序數據。具體步驟：（1）修剪序列末端（5'端和3'端）低質量（質量值小于20）的堿基；（2）使用Cutadapt軟件去除含N比率超過 10% 的堿基序列。

2結果

2.1差異表達基因篩選本研究通過ceRNA芯片技術對膿毒癥患者血液樣本進行全轉錄組分析，經過嚴格的數據標準化處理和差異表達分析，共發現274個差異表達的lncRNA，包括248個上調和26個下調IncRNA。為直觀展示這些差異表達基因的特征，分別采用散點圖展示基因表達量分布，火山圖呈現差異表達基因的統計學顯著性，熱圖顯現各組樣本間的表達模式差異。見圖1和圖2。

紅色：2倍上調基因；綠色：2倍下調基因。

左圖，X軸：探針點在對照芯片中標準化后的信號值。Y軸：探針點在樣品芯片中標準化后的信號值。落在圖形中 y=x 直線（圖上中位線）上的點代表這個探針點在兩張芯片中信號值差異Fold Chang ：=1 ，落在圖形中位線兩側45度線之外的點代表這個探針點在兩張芯片中信號值差異Fold Changegt;2。右圖，X軸：Log2（Fold Change），Y軸： -Log10（P 值）。X軸平行線 ：P 值 =0.05，Y 軸平行線：Fold Change ：=2 ；紅色區域： P 值 lt;0.05 Fold Change ?2 的差異基因;綠色區域： P 值 lt;0.05 、Fold Change ?0.5 的差異基因。

圖1lncRNA散點圖和火山圖

圖2IncRNA熱圖

黃色：表示基因表達水平無變化；紅色：2倍上調基因；綠色：2倍下調基因。

2.2IncRNA通過順式機制調控膿毒癥疾病的關鍵途徑通過對膿毒癥中具有順式（cis）調控作用的lncRNA進行ceRNA芯片檢測及GO富集分析，結果顯示其顯著富集的生物過程主要包括細胞過程、生物調控和代謝過程；細胞組分主要富集于細胞、細胞部分和細胞器；而分子功能則主要集中在結合和催化活性。提示膿毒癥中IncRNA可能通過順式調控機制廣泛參與細胞基本生命活動、基因表達調控及代謝過程，并可能通過與蛋白質或核酸分子的結合或影響酶活性來發揮生物學功能，進而影響疾病的發生發展。見圖3。

通過對膿毒癥中具有順式調控作用的lncRNA進行ceRNA芯片檢測及GO富集分析，選取Top30的顯著富集通路進行深人解析。結果顯示，這些lncRNA參與調控多種生物過程，其中最顯著的是參與蛋白激酶B信號傳導調節和蛋白激酶B信號傳導等關鍵通路。此外，磷酸酶結合等蛋白相互作用功能也發揮重要作用。表明膿毒癥中IncRNA可能通過順式調控機制廣泛參與AKT等關鍵信號轉導過程，并通過與磷酸酶等調控蛋白的相互作用，在疾病炎癥反應和免疫細胞功能調控中扮演重要角色。見圖4。

2.3對膿毒癥中具有反式調控作用的lncRNA進行GO富集分析通過ceRNA芯片對膿毒癥中具有反式（trans）調控作用的IncRNA進行GO富集分析，結果顯示這些IncRNA在生物過程方面顯著富集于細胞過程和代謝過程；在細胞組分方面主要分布于細胞、細胞部分和細胞器；而在分子功能方面則主要涉及結合和催化活性。表明膿毒癥中具有反式調控作用的lncRNA可能通過參與細胞基本生命活動、調控代謝過程以及與蛋白質或核酸結合或發揮酶活性等方式，在疾病的發生發展中發揮重要作用。見圖5。

通過對膿毒癥中具有反式調控作用的lncRNA進行ceRNA芯片檢測及GO富集分析，選取Top30顯著富集通路進行深入解析。結果顯示，這些lncR-NA主要參與調控多種生物過程，其中最為顯著的是參與干擾素β產生的調節和干擾素β產生。在細胞組分方面，這些lncRNA顯著富集于高爾基體膜內在成分等亞細胞結構。表明膿毒癥中具有反式調控作用的lncRNA可能通過調節干擾素 β 等關鍵免疫因子的產生，并靶向高爾基體等細胞器，在宿主免疫應答和炎癥反應調控中發揮重要作用。見圖6。

2.4對膿毒癥相關lncRNA的順式靶基因進行KEGG通路分類分析基于ceRNA芯片對膿毒癥相關lncRNA的順式靶基因進行KEGG通路分類分析，結果顯示這些靶基因主要參與以下六大功能模塊：在細胞過程中顯著富集于運輸與分解代謝通路；在環境信息處理方面主要涉及信號轉導過程；在遺傳信息處理中主要參與翻譯調控；在人類疾病方面與特定類型癌癥相關通路存在顯著關聯；在代謝過程中主要調控脂質代謝；在機體系統方面則顯著富集于免疫系統相關通路。這些發現揭示了膿毒癥中LncR-NA可能通過順式調控作用影響多個關鍵生物學通路，特別是免疫調節和代謝重編程過程，為深入理解膿毒癥的發病機制提供了新的分子視角。見圖7。

基于ceRNA芯片對膿毒癥相關lncRNA的順式靶基因進行KEGG通路富集分析，選取Top30顯著富集的信號通路進行深人解析。研究發現，軸突導向和光傳導等神經相關通路表現出顯著富集特征。這些結果表明，在膿毒癥病理過程中IncRNA可能通過順式調控機制參與神經信號傳導和感覺信息處理等生物學過程，提示神經系統調控可能在膿毒癥的全身炎癥反應中發揮重要作用，為探索膿毒癥多器官功能障礙的分子機制提供了新的研究方向。見圖8。

圖8ceRNA芯片對膿毒癥相關IncRNA的順式靶基因進行KEGG通路分類分析TOP30

2.5ceRNA芯片對膿毒癥相關lncRNA的反式靶基因進行KEGG通路分類分析基于ceRNA芯片對膿毒癥相關IncRNA的反式靶基因進行KEGG通路分類分析，結果顯示這些靶基因主要參與以下功能模塊：在細胞過程中顯著富集于運輸與分解代謝通路；在環境信息處理方面主要參與信號轉導過程；在遺傳信息處中主要涉及蛋白質折疊、分選和降解；在人類疾病方面與特定類型癌癥相關通路存在顯著關聯；在代謝過程中主要調控脂質代謝；在機體系統方面則顯著富集于免疫系統相關通路。這些發現表明，膿毒癥中IncRNA可能通過反式調控作用影響多個關鍵生物學過程，特別是免疫應答和代謝調控網絡，為深人解析膿毒癥的分子機制提供了新的理論依據。見圖9。

通過對膿毒癥相關IncRNA的反式靶基因進行KEGG通路富集分析，選取Top30顯著富集的信號通路進行深入研究。結果顯示，基礎轉錄因子和糖基磷脂酰肌醇錨定生物合成等通路表現出顯著富集特征。表明在膿毒癥病理過程中IncRNA可能通過反式調控機制影響基因轉錄起始和蛋白質膜錨定修飾等關鍵生物學過程，為深入理解膿毒癥中基因表達調控異常和細胞膜功能紊亂的分子機制提供了新的研究方向。見圖10。

圖10ceRNA芯片對膿毒癥相關IncRNA的反式靶基因進行KEGG通路分類分析TOP30

3討論

膿毒癥作為一種由感染引發的全身性炎癥反應綜合征，其高死亡率主要歸因于早期診斷困難及缺乏特異性治療手段。膿毒癥常伴隨多器官功能障礙，包括心血管功能異常、急性肺損傷和急性腎損傷，是導致其高死亡率的重要原因[。深入解析膿毒癥的病理生理過程對于優化臨床治療策略及開發新型療法具有重要意義。

近年來ncRNA在膿毒癥發病機制中的關鍵調控作用逐漸被揭示，為理解膿毒癥的復雜病理生理過程提供了新的視角。其中，多項最新研究表明lncRNA通過調控多種生物學過程參與膿毒癥器官功能障礙的發生發展[8。隨著高通量測序和基因芯片技術的發展，越來越多的研究揭示了IncRNA在不同疾病中的表達模式，證實其在生理和病理條件下的差異表達可能參與膿毒癥等疾病的發生[9。本研究通過ceRNA芯片技術，篩選出274個差異表達的lncRNA，包括248個上調和26個下調lncRNA，揭示IncRNA通過多維度調控ceRNA網絡參與膿毒癥病理生理過程，為生物標志物及潛在靶向治療提供新思路。

有研究表明，IncRNA（如MALAT1、NEAT1）可通過調控 NF-κB NLRP3等炎癥通路加劇或抑制免疫反應20。本研究中差異表達的IncRNA上調基因約占 90.5% ，說明炎癥信號（如 NF-κB ）可能直接激活非編碼RNA轉錄。通過構建ceRNA網絡，發現hub基因的靶miRNA預測IncRNA主導“免疫模塊”（調控干擾素信號和抗原呈遞）2l。通過對差異表達的具有順式調控作用的IncRNA以及具有反式調控作用的IncRNA進行GO富集分析，結果顯示這些lncRNA廣泛參與細胞基本生命活動、基因表達調控及代謝過程，并可能通過與蛋白質或核酸分子的結合或影響酶活性來發揮其生物學功能。差異表達的lncRNA可能通過順式調控機制廣泛參與AKT信號通路等關鍵細胞信號轉導過程，并通過與磷酸酶等調控蛋白的相互作用，在疾病發生發展中產生影響；膿毒癥中具有反式調控作用的IncRNA可能通過調節干擾素β等關鍵免疫因子的產生，并靶向高爾基體等細胞器，在宿主免疫應答和炎癥反應調控中起到重要作用。KEGG分析揭示的PI3K-AKT通路富集值得深入探討。本研究發現，順式作用的lncRNA（如LNCAROD）鄰近調控AKT1基因，而反式作用的IncRNA（如MALAT1）則通過結合轉錄因子（如STAT3）遠程調控AKT表達。這種雙重調控可能形成\"快速響應-持續激活\"的時序模式：順式作用在感染初期快速啟動AKT信號，反式作用則維持后期代謝重編程。這與膿毒癥患者血糖動態變化（早期高血糖 $$ 后期低血糖）的臨床觀察高度一致。代謝紊亂與免疫失調的相互促進是膿毒癥的核心特征[]。

lncRNA調控的GPI錨定生物合成異常（ P=4.6× 10^-5 ）可能影響CD14等受體膜定位，導致LPS敏感性改變。這些發現將“免疫-代謝軸\"理論從蛋白質層面擴展至RNA調控層面?！拜S突導向”通路在lncRNA順式靶標中的富集 P=7.3×10^-6 是本研究的重要發現。差異基因如SLIT2、ROBO1原本參與神經元遷移，卻在膿毒癥中異常表達。近年研究表明，迷走神經通過 α7nAChR 受體參與神經元受體調控巨噬細胞功能22，我們的結果提示IncRNA可能介導這種“神經-免疫對話”，這為探索迷走神經刺激治療膿毒癥提供了分子靶點。我們在該研究的基礎上，預實驗結果顯示靶向lncRNA肺腺癌轉移相關轉錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript1，MALAT1）的反義寡核苷酸（antisense oligonu-cleotides，ASO）藥物可改善膿毒癥小鼠的生存率。與Seymour等提出的膿毒癥分子分型（MARS分類）相比，本研究發現的ceRNA網絡更傾向于內毒素型（以脂多糖反應為特征）和炎癥型。特別值得注意的是，我們的PI3K-AKT調控模塊與Hotchkiss提出的“免疫抑制學說”形成有趣互補：AKT信號過度激活可能導致免疫細胞“耗竭”，而不僅是功能抑制。這一發現可能為膿毒癥分期治療提供新思路一早期抑制AKT，后期增強其活性。

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