基因治療最新研究進(jìn)展綜述

1 基因治療的緣起

傳統(tǒng)一線治療藥物在治療遺傳性疾病和惡性腫瘤時(shí)，大多僅能暫時(shí)緩解癥狀，但不能控制疾病繼續(xù)惡化，而且還會(huì)引發(fā)不良反應(yīng)。另外，對(duì)惡性腫瘤的手術(shù)治療不能很好地解決正常組織的修復(fù)與重建問題，更不能逆轉(zhuǎn)原來組織器官的進(jìn)一步被破壞的進(jìn)程。近年來惡性腫瘤的生物治療發(fā)展迅速，與傳統(tǒng)藥物相比，生物制劑具有藥理作用選擇性高、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，但也存在價(jià)格昂貴、生物效價(jià)低、需反復(fù)注射等缺點(diǎn)。因此，人們一直在探索更為理想的治療模式。隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和免疫生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展和交叉滲透，基因治療已日受關(guān)注，它不僅可以彌補(bǔ)上述不足，而且還可以針對(duì)其發(fā)病機(jī)制，在分子水平進(jìn)行治療。基因治療在當(dāng)今是一個(gè)非常熱門的課題，在肝癌、慢性乙型肝炎、冠心病、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、骨性關(guān)節(jié)炎、人工假體周圍骨溶解、消化系統(tǒng)等疾病的治療研究中，都已取得相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展。可以預(yù)見，在不久的將來，基因治療必將產(chǎn)生巨大影響。

2 基因治療的范疇

基因治療最初的范疇是使用正常有功能的基因替代或修正缺陷基因，即指將外源性的、有特定功能的遺傳物質(zhì)通過一定的技術(shù)手段導(dǎo)入靶細(xì)胞，并在一定條件下產(chǎn)生治療作用的治療方式，從而達(dá)到治療疾病的目的。目前認(rèn)為，將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到機(jī)體內(nèi)的治療方法均可稱之為基因治療，現(xiàn)在已逐步拓展至基因增強(qiáng)治療，其中包括DNA疫苗治療、反義基因治療及核酶治療等。治療范圍也已從常見的單基因疾病擴(kuò)大至多基因疾病，從遺傳性疾病擴(kuò)展至獲得性疾病。基因治療作為一種全新的治療理念現(xiàn)在越來越受到人們的關(guān)注。當(dāng)前基因治療的研究主要集中在適宜治療基因的篩選，用來投遞治療基因的高靶向性、高效率、高承載量、低副作用的載體構(gòu)建以及對(duì)轉(zhuǎn)入基因表達(dá)調(diào)控與監(jiān)測(cè)等方面。

2．1 基因治療

基因治療可分為生殖細(xì)胞基因治療和體細(xì)胞基因治療兩大類。前者是將正常基因轉(zhuǎn)移到病人的生殖細(xì)胞，使其發(fā)育成正常個(gè)體，顯然這是比較理想的方法，但實(shí)際上，這種靶細(xì)胞的遺傳修飾至今尚無實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。由于基因的此種轉(zhuǎn)移一般只能用顯微注射，因而效率不高，且僅適用于排卵周期短而次數(shù)多的動(dòng)物，所以很難適用于人類。加之由于受精卵或早期胚胎細(xì)胞的遺傳改變勢(shì)必會(huì)影響后代，倫理學(xué)上的障礙和技術(shù)難度也使生殖細(xì)胞基因治療仍被列為禁區(qū)。

2．2 體細(xì)胞基因治療

體細(xì)胞基因治療是指將正常基因轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞，使之表達(dá)基因產(chǎn)物，以達(dá)到治療目的。該治療不必矯正所有的體細(xì)胞，理由是每個(gè)個(gè)體細(xì)胞都具有相同的染色體，且有些基因只在特定類型的體細(xì)胞中表達(dá)，所以治療只需集中到此類細(xì)胞上。另外，某些疾病只需少量基因產(chǎn)物即可改善癥狀，而不需全部有關(guān)體細(xì)胞均充分表達(dá)。體細(xì)胞基因治療只涉及體細(xì)胞的遺傳改變，并不影響下一代，在現(xiàn)代倫理道德上也是可行的，故現(xiàn)已被廣泛用于嚴(yán)重疾病的治療。

3 基因治療的技術(shù)、策略

目前基因治療的技術(shù)有：RNAi技術(shù)、反義RNA技術(shù)、反義DNA技術(shù)和核酶技術(shù)、轉(zhuǎn)干擾素基因技術(shù)。總的來說基因治療的策略包括基因替代、基因修正、基因增強(qiáng)、基因抑制和基因失活。基因替代是指將整個(gè)變異基因去除，用正常基因取而代之，使致病基因得到永久更正，就像外科移植手術(shù)一樣。這無疑是最理想的方法，但目前尚未實(shí)現(xiàn)。

基因修正是指將致病基因的突變堿基序列糾正，而正常部分予以保留。盡管這方面的研究同樣存在較大困難，但基因靶向技術(shù)(同源基因重組)的研究進(jìn)展已表明，哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組確實(shí)存在著某些結(jié)構(gòu)和酶學(xué)機(jī)制，可使外源DNA在特定的部位進(jìn)行重組，從而使缺陷基因在原位特異性修復(fù)成為可能。

基因增強(qiáng)是指將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其他細(xì)胞，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物可以補(bǔ)償缺陷細(xì)胞的功能，或使原有功能得到加強(qiáng)。近10年來，許多研究方法已可將目的基因?qū)胝婧思?xì)胞，并獲得表達(dá)，因而被認(rèn)為是目前較為成熟的方法。這一方案最適宜隱性單基因疾病的治療。

基因抑制和基因失活是采取導(dǎo)入外源基因去干擾、抑制有害基因的表達(dá)，如向腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入腫瘤抑制基因，以抑制腫瘤基因的表達(dá)。此外，最近興起的反義技術(shù)也可通過導(dǎo)入特異核酸序列，阻斷某些特定基因的表達(dá)，以達(dá)到抑制有害基因表達(dá)的目的。

4 基因治療成功的關(guān)鍵

目的基因的有效導(dǎo)入和表達(dá)是基因治療成功的前提。基因轉(zhuǎn)移的實(shí)施途徑有2類。

一類是離體轉(zhuǎn)移，將治療對(duì)象的細(xì)胞從體內(nèi)取出，體外培養(yǎng)并以選擇的載體系統(tǒng)導(dǎo)入適當(dāng)?shù)闹亟M基因，而后將此經(jīng)基因修飾的細(xì)胞重新回輸體內(nèi)。Ex vivo方法比較經(jīng)典安全，效果較易控制，是早期基因治療所采取的方法，至今許多基因治療方案，包括骨髓細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的基因修飾仍繼續(xù)采用此方法，但技術(shù)難度大，不易推廣

另一類是體內(nèi)直接轉(zhuǎn)移，將帶有遺傳物質(zhì)的病毒、脂質(zhì)載體或裸露DNA等直接注射到體內(nèi)。In vivo方法操作簡(jiǎn)便，易于推廣，但目前尚不成熟，療效較短，且存在免疫排斥和安全性等問題。

基因轉(zhuǎn)移的方法有物理、化學(xué)和生物3大類。

基因轉(zhuǎn)移常用的物理法有顯微注射、電打孔、基因槍等。

化學(xué)法常用的有脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移法和磷酸鈣轉(zhuǎn)染法。由于脂質(zhì)體在體內(nèi)可以降解，因此對(duì)機(jī)體無毒性，也沒有免疫原性，不會(huì)導(dǎo)致炎性反應(yīng)，而且易制備、成本低，是基因治療載體研究的一個(gè)新方向。日本的Kikuchi等研制的一系列新的脂質(zhì)體就具有更高的轉(zhuǎn)染效率，體外在含有胎牛血清的培養(yǎng)基中也能介導(dǎo)對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，在體內(nèi)能介導(dǎo)腹腔擴(kuò)散的腫瘤組織的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。

生物法主要是指病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，包括RNA病毒、DNA病毒2類；目前研究最為系統(tǒng)深入的病毒載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關(guān)病毒載體和單純皰疹病毒載體。有研究對(duì)2557例患者基因治療所用的基因載體類型統(tǒng)計(jì)為：逆轉(zhuǎn)錄病毒(43．5％)、脂質(zhì)體(25．9％)、腺病毒(11．O％)、逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞(6．1％)、痘苗病毒(4．4％)、轉(zhuǎn)染(3.6％)、裸DNA(2．1％)，還有腺相關(guān)病毒、基因槍、電打孔等。有關(guān)給藥途徑，常用的是向腫瘤組織內(nèi)直接注射，或在超聲或CT導(dǎo)向下定位注射。這種方法簡(jiǎn)單易行，但即使是多點(diǎn)注射，也難以使全部腫瘤細(xì)胞接觸到病毒，對(duì)體積較小的腫瘤還存在給藥體積受限制的問題。值得推薦的是以介入治療為基礎(chǔ)的基因治療，即通過動(dòng)脈插管將基因藥物輸送到腫瘤內(nèi)。這一方法尤其適用于肝癌的基因治療，因肝癌是富血供的腫瘤，幾乎100％供血來自肝動(dòng)脈；此外還有能吸附并沉淀于腫瘤組織的碘油技術(shù)、能緩釋藥物的動(dòng)脈內(nèi)支架技術(shù)等都將為基因治療帶來新的希望。

5 基因治療存在的問題和發(fā)展方向

5．1 新的目的基因?qū)ふ?/p>

盡管目前有多種細(xì)胞因子基因、抑癌基因等可用于腫瘤的基因治療，但總體來講，效果尚不理想，尚有多種疾病的基因未被分離出，因而尋找更多更具殺傷腫瘤細(xì)胞能力的基因?qū)⒋蟠笸苿?dòng)基因治療的研究和應(yīng)用范圍。隨著人類基因組計(jì)劃的完成，將會(huì)為基因治療提供更多的有價(jià)值的目的基因。

5．2 構(gòu)建高效特異載體系統(tǒng)

加強(qiáng)細(xì)胞特異性基因表達(dá)載體的研究是一個(gè)重要的課題。近年來表達(dá)載體研究已成為基因轉(zhuǎn)移載體研究的主攻方向，新型表達(dá)載體不但保持了原來的優(yōu)點(diǎn)，更對(duì)許多不足之處作了重大改進(jìn)，從而使這方面的研究有了新的突破。如嵌合病毒載體是通過分子生物學(xué)將2種或2種以上的病毒載體結(jié)合起來，從而得到一種具有各家之長(zhǎng)而無各家之短的新型嵌合病毒載體。近年來，有利用超聲對(duì)比劑微泡作為基因載體并用超聲技術(shù)處理，提高轉(zhuǎn)染率取得成功。納米技術(shù)的應(yīng)用，也可能在此領(lǐng)域有所突破。

5．3 通過基因調(diào)控進(jìn)行更加精確的基因治療

目前，基因治療大都采用基因轉(zhuǎn)移手段對(duì)缺陷基因進(jìn)行修正、替代，給細(xì)胞增加有意義的基因；可以考慮通過對(duì)某些基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控來進(jìn)行治療。此種方法號(hào)稱為第二代基因治療。針對(duì)肝癌基因治療中多采用AFP基因，插入其5′端區(qū)域，含有啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等序列，在AFP陽性細(xì)胞中可以啟動(dòng)轉(zhuǎn)移基因的轉(zhuǎn)錄，在AFP陰性細(xì)胞不能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，從而實(shí)現(xiàn)在AFP陽性細(xì)胞中特異性表達(dá)病毒轉(zhuǎn)移基因。

5．4 與其他手段有機(jī)結(jié)合

基因治療可與其他方法，如與外科手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療和介入治療等有機(jī)地結(jié)合，發(fā)揮綜合治療的優(yōu)勢(shì)，產(chǎn)生疊加效應(yīng)。這是一個(gè)大有可為的研究方向。

5．5 準(zhǔn)確的療效評(píng)價(jià)

體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不一定與最終臨床應(yīng)用的結(jié)果相一致，況且，目前的人體臨床試驗(yàn)中，限于倫理問題，多選擇常規(guī)治療失敗或晚期腫瘤患者，難以客觀地評(píng)價(jià)出治療效果。因此，有必要建立客觀準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)方法體系，通過更多的臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其準(zhǔn)確療效。