淺談轉(zhuǎn)基因動物的研究進(jìn)展

摘 要 回顧了國內(nèi)外關(guān)于轉(zhuǎn)基因的研究，對轉(zhuǎn)基因動物獲得的主要方法如顯微原核注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法等常用的方法進(jìn)行了綜述；闡述了轉(zhuǎn)基因動物的鑒定方法，最后對轉(zhuǎn)基因動物在理論和實(shí)踐方面的應(yīng)用情況進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞 轉(zhuǎn)基因 轉(zhuǎn)基因動物 轉(zhuǎn)基因技術(shù)

轉(zhuǎn)基因動物始于20世紀(jì)70年代末，是目前生物技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，具有重大的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。轉(zhuǎn)基因動物是通過向受精卵或早期胚胎中導(dǎo)入外源DNA，有目的地對生物的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行修飾、改造，培育新的品系。若外源基因與動物本身的基因(染色體)整合在一起，外源基因就能隨細(xì)胞的分裂而增殖，在體內(nèi)得到表達(dá)，并能穩(wěn)定地遺傳給后代。轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和生物制藥等領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，如定向育種、建立人類疾病的病理模型、轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器等。

1．轉(zhuǎn)基因動物的研究概況

1.1轉(zhuǎn)基因動物的國外研究

轉(zhuǎn)基因動物的研究最早始于1980年，高登等用顯微原核注射方法，將重組DNA導(dǎo)人小鼠受精卵，首次獲得了帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。帕米特于1982年也獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠，并通過實(shí)驗(yàn)證明融合基因可以在宿主體內(nèi)得到有效正確地表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物可以在宿主動物內(nèi)行使功能。哈姆爾等成功獲得了轉(zhuǎn)基因兔、綿羊和豬，這項(xiàng)工作被認(rèn)為在轉(zhuǎn)基因動物研究歷程上具有重要意義。

1997年克隆羊“多莉”的誕生在轉(zhuǎn)基因動物歷史上具有劃時(shí)代的意義，它突破了有性生殖的框架，表明了高等動物也可以通過無性生殖來繁殖。茲伯爾于1998年利用該法分別得到轉(zhuǎn)基因克隆牛和用來治療人血友病的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊。近年來利用轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)又獲得了克隆豬、體內(nèi)含有外源基因的轉(zhuǎn)基因豬、體內(nèi)有2個(gè)基因被“關(guān)閉”了的轉(zhuǎn)基因克隆豬和基本不含人體免疫排斥基因的“基因敲除”克隆豬等。

1.2轉(zhuǎn)基因動物的國內(nèi)研究概況

我國于1984年開始了轉(zhuǎn)基因動物的相關(guān)研究，并獲得了含入β－珠蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。隨后獲得了含人生長激素(MT-HGH)基因的轉(zhuǎn)基因泥鰍和小鼠。1987年獲得含有大腸桿菌galk和gpt基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。以后又相繼獲得了含HbgAg乙型肝炎表面抗原基因的轉(zhuǎn)基因兔、轉(zhuǎn)基因豬、含EPO基因和人乙型肝炎表面抗原基因(HbgAg)2種乳腺特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因山羊、含入凝血因子Ⅸ的轉(zhuǎn)基因山羊、含人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因奶牛、含“生物鋼”蛋白基因的轉(zhuǎn)基因老鼠等。

2．轉(zhuǎn)基因的主要技術(shù)

2.1顯微原核注射法

高登等首次建立的轉(zhuǎn)基因方法，基本過程是：利用顯微操作系統(tǒng)和顯微注射技術(shù)將外源基因直接通過注射器注入實(shí)驗(yàn)動物的受精卵中，再通過胚胎移植技術(shù)將整合有外源基因的受精卵移植到受體子宮內(nèi)繼續(xù)發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。實(shí)驗(yàn)的過程中大多數(shù)轉(zhuǎn)基因動物能把整合的基因傳給后代，以建立轉(zhuǎn)基因動物體系。隨后，葛瑞姆菲利用顯微原核注射法成功獲得了轉(zhuǎn)基因牛。

2.2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法

杰內(nèi)士利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為轉(zhuǎn)基因載體，感染胚胎成功獲得轉(zhuǎn)基因動物：將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA載體上，制成高滴度的病毒顆粒，人為感染著床前或著床后的胚胎，外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞后，反轉(zhuǎn)錄為DNA，并在整合酶和其末端特殊核酸序列的作用下整合到宿主細(xì)胞的基因組中進(jìn)行表達(dá)和遺傳得到轉(zhuǎn)基因動物。

2.3胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法

胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)是早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)經(jīng)體外培養(yǎng)建立起來的多功能細(xì)胞系，利用反轉(zhuǎn)錄病毒載體、電擊法等將外源基因?qū)隕S細(xì)胞內(nèi)，外源基因通過隨機(jī)插入或者同源重組的方式整合到胚胎干細(xì)胞的基因組中，然后把轉(zhuǎn)染的胚胎干細(xì)胞注射入受體囊胚腔，參與各種嵌合體的形成。將來出生的動物的生殖系統(tǒng)就有可能整合有外源基因，通過雜交繁育得到含純合目的基因的個(gè)體，即為轉(zhuǎn)基因動物。

2.4精子載體法

精子載體法分為體外受精法和胞質(zhì)內(nèi)顯微注射法。布蘭克首先利用體外受精法成功獲得了轉(zhuǎn)基因動物：將成熟的精子與外源DNA進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，精子核后帽區(qū)結(jié)合DNA后，與卵子受精形成的受精卵帶有外源DNA。安斯內(nèi)利用胞質(zhì)內(nèi)顯微注射法制作轉(zhuǎn)基因小鼠：預(yù)先將小鼠精子進(jìn)行破膜處理，與編碼綠色熒光蛋白質(zhì)或編碼β－半乳糖苷的Lacz基因的外源DNA短時(shí)間共孵育，然后用顯微注射法注入MII期的卵母細(xì)胞質(zhì)中，得到的轉(zhuǎn)基因胚胎轉(zhuǎn)移到假孕母鼠的子宮中進(jìn)行整合，從而得到轉(zhuǎn)基因小鼠。

2.5體細(xì)胞核移植轉(zhuǎn)基因法

士內(nèi)克等用體細(xì)胞核移植轉(zhuǎn)基因法制作了世界上首例轉(zhuǎn)基因羊：將外源基因?qū)氲絼游锍赡牦w細(xì)胞或胎體成纖維細(xì)胞中，再將該細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，選擇其中帶有外源基因的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，用這種細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行核移植，將重組胚進(jìn)行培養(yǎng)，或者植入同步化假孕動物的輸卵管，從而得到轉(zhuǎn)基因動物。

3．轉(zhuǎn)基因動物的鑒定

3.1 DNA水平的檢測

在DNA水平上對轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行檢測鑒定，有Southern blotting和PCR等可以用于轉(zhuǎn)基因動物的檢測。Southern blotting檢測時(shí)提取待檢動物的組織樣(如鼠尾巴)或血液中的基因組DNA，一般選擇導(dǎo)入基因中的單一限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，消化后電泳，轉(zhuǎn)膜后選擇適當(dāng)?shù)奶结樳M(jìn)行雜交，通過放射自顯影獲得結(jié)果，該方法的檢測結(jié)果明確可靠，但過程復(fù)雜，工作量大。

PCR檢測時(shí)可以利用三引物法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的檢測：在導(dǎo)入基因的調(diào)控序列上合成一條引物，在目的基因上合成第二條引物，在內(nèi)源基因上合成第三條引物。利用這3條引物同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽性擴(kuò)增出現(xiàn)2條DNA條帶，而陰性擴(kuò)增只出現(xiàn)l條特定的內(nèi)源性DNA帶。這樣既可以減少篩選中的假陽性，同時(shí)還可以提高檢測的準(zhǔn)確性。

3.2 RNA水平的檢測

Northern blotting和RT-PCR可以在RNA水平上對轉(zhuǎn)基因的整合表達(dá)進(jìn)行檢測。此類實(shí)驗(yàn)檢測的關(guān)鍵在于特異性探針設(shè)計(jì)。

RT-PCR技術(shù)與Northern blotting一樣，可用來檢測外源基因轉(zhuǎn)移整合至受體動物基因序列中后的表達(dá)情況，它們都能對特定的mRNA進(jìn)行定量檢測不同的是，RT-PCT具有更高的敏感性，能檢測含量稀少的mRNA。所以對于轉(zhuǎn)基因表達(dá)活性低的這一狀況，它具有較強(qiáng)的適用性。

3.3 目的蛋白的檢測

目的蛋白的主要檢測方法主要有SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)和Western blotting分析法。

4．轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用

4.1 轉(zhuǎn)基因動物在基礎(chǔ)理論方面的應(yīng)用

外源動物基因可在轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞中整合、表達(dá)受整體制約、基因組遺傳背景的調(diào)控，所以可把轉(zhuǎn)基因當(dāng)作一個(gè)理想的功能標(biāo)記。而且可把分子、細(xì)胞、和整體動物水平的研究統(tǒng)一起來，從時(shí)間和空間的角度進(jìn)行綜合地考慮，其結(jié)果更能反映活體內(nèi)情況。因此轉(zhuǎn)基因動物可以用于研究基因的表達(dá)調(diào)控、結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，以及細(xì)胞發(fā)育的潛能性、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的相互關(guān)系、胚胎發(fā)育調(diào)控、腫瘤和神經(jīng)發(fā)育等。

4.2轉(zhuǎn)基因動物在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

4.2.1 疾病的動物模型

轉(zhuǎn)基因動物的成功為人類疾病的模型的構(gòu)建提供了良好的基礎(chǔ)。人類可以通過精確地使某些基因失活或增強(qiáng)某些基因的表達(dá)來建立離體的實(shí)驗(yàn)動物體系，不但能從動物整體水平和組織器官水平進(jìn)行研究，還可深入到細(xì)胞水平和分子水平。由于模型在活體動物中構(gòu)建，因此可以按照人們的愿望進(jìn)行設(shè)計(jì)和培育，又因?yàn)檫@樣可保證類似體內(nèi)的各種背景因素仍然存在，所以研究的結(jié)果通常具有較高的真實(shí)性。目前人們已建立起的疾病的動物模型的遺傳病有格式鐮刀狀細(xì)胞貧血、地中海貧血、高血壓、人類來西一尼南綜合征(Losh-Nynansyndrome，LNS)、自身免疫病、老年癡呆癥和淋巴系統(tǒng)病等。

4.2.2人類異種器官的移植

同種器官的移植中存在2個(gè)問題：(1)供移植用的器官來源不足；(2)人類移人的器官多發(fā)生免疫排斥現(xiàn)象，這使得人們不得不重視異種器官移植，利用轉(zhuǎn)基因動物是解決器官移植短缺的最有效途徑之一。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明目前最為理想的轉(zhuǎn)基因動物是豬。

4.3轉(zhuǎn)基因動物在醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)基因動物制藥具有設(shè)備簡單、不耗能、無污染、品種多、產(chǎn)量高、質(zhì)量好、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，而且可以通過血液、尿液和乳腺收集轉(zhuǎn)基因蛋白。

乳腺是外源基因在轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)最理想的表達(dá)場所。因?yàn)槿橄偈且粋€(gè)外分泌器官，乳汁不進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)，不會影響轉(zhuǎn)基因動物本身的代謝反應(yīng)，而且動物乳腺具有很強(qiáng)的攝取、合成以及分泌蛋白質(zhì)的功能，并能對重組蛋白進(jìn)行多種翻譯后加工，具有穩(wěn)定的生物反應(yīng)，且易提純，所以被稱為轉(zhuǎn)基因動物乳腺反應(yīng)器。

4.4轉(zhuǎn)基因動物在畜牧獸醫(yī)上的應(yīng)用

轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)可以改善動物本身的基因組，從而改變動物的遺傳本質(zhì)。操作中利用重組DNA技術(shù)構(gòu)造出各種優(yōu)良的載體，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，植入動物的卵細(xì)胞，培育出新品種。

轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)還可以提高動物的產(chǎn)毛性能。1995年，布拉克把類胰島素生長因子－I(IGF-I)的基因轉(zhuǎn)入受體羊的原核胚中，使轉(zhuǎn)基因羊的產(chǎn)毛率得到了極大的提高。

克爾姆茲等將Visna病毒的衣殼蛋白基因轉(zhuǎn)入綿羊體內(nèi)，獲得了抗病能力明顯提高的轉(zhuǎn)基因綿羊，培育出了動物抗病新品種。

目前，轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用主要在醫(yī)藥方面，而在食品工業(yè)中的應(yīng)用尚受到較大的制約，其根本原因是轉(zhuǎn)基因動物的開發(fā)投入很大，而轉(zhuǎn)基因的技術(shù)瓶頸也使轉(zhuǎn)基因成功率比較低。盡管如此，它還是顯示出了在工業(yè)、農(nóng)業(yè)及醫(yī)學(xué)等行業(yè)中的巨大應(yīng)用潛力和發(fā)展前景，給人類帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益，推動了社會向前發(fā)展。相關(guān)法規(guī)的出臺，無疑會加速和正確引導(dǎo)基因工程產(chǎn)品的研究和開發(fā)。相信在不久的將來，轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)將會成為生產(chǎn)行業(yè)中的一種新興產(chǎn)業(yè)。因此充分利用轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的潛在價(jià)值，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的實(shí)用化、商業(yè)化、產(chǎn)業(yè)化，是新世紀(jì)生物科學(xué)工作者的努力目標(biāo)。