大蔥雄性不育系及保持系花藥和花粉發育的細胞學比較研究

摘要: 為了從細胞學角度研究大蔥雄性不育的機理， 利用石蠟切片法對大蔥雄性不育系及保持系花藥與花粉發育過程進行比較研究。觀察結果表明: 大蔥雄性不育系和保持系的小孢子母細胞都能正常進行減數分裂， 四分體可以釋放出小孢子。雄性不育系的花粉敗育發生于單核小孢子時期， 具有單核敗育的特征。觀察發現大蔥雄性不育系的小孢子有2 種敗育類型: ( 1) 絨氈層細胞正常發育， 但中層細胞發生了延遲解體的現象， 小孢子時期仍然存在， 與逐漸縮小的藥室一起擠壓小孢子細胞成一染色極深的團塊狀物質; ( 2) 絨氈層提前解體， 不能提供小孢子發育所需的營養， 小孢子的細胞質和細胞核逐漸解體， 僅剩下內空的花粉粒。花粉敗育不僅與絨氈層有關， 還與中層細胞密切相關。

關鍵詞: 大蔥; 雄性不育; 小孢子發育

大蔥(Allium fistulosum L.) 是我國栽培的重要蔥蒜類蔬菜之一。目前， 利用雄性不育系是生產大蔥雜交種的唯一途徑。20 世紀70 年代張啟沛等[1]在大蔥自然群體中發現了雄性不育株， 并認為在我國大蔥地方品種中雄性不育廣泛存在。山東農業大學和山東省章丘市農業局以章丘大蔥中發現的雄性不育株為不育源， 育成雄性不育系， 不育株率在95% 以上， 并利用雄性不育系配制了一些雜交組合[2]。有關細胞質雄性不育的細胞學機理研究在擬南芥、大豆、水稻、油菜等作物上已有報道[3- 6]， 但國內外對大蔥雄性不育研究較少， 對其不育機理尚不十分清楚， 本試驗以1 份大蔥雄性不育系及其保持系為試材， 采用石蠟切片技術， 觀察雄性不育系和相應可育保持系小孢子的發育過程， 探索大蔥雄性不育系花粉敗育的時期和方式， 以了解大蔥的雄性不育細胞學特征及雄性不育機理， 為大蔥雄性不育系的研究和應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

本試驗以1 份大蔥雄性不育系及其相應保持系( 從章丘大蔥中選育而成) 花蕾作為研究材料， 于2005 年7 月24 日取不同生長發育期的花蕾按大小分級后迅速用50% 的FAA 固定液固定24 h， 逐級酒精脫水， 石蠟包埋， 采用常規石蠟切片法制片， 切片厚度10 !m， 番紅固綠染色法染色， 用加拿大樹膠封片。最后用Olympus BH- 2 型攝像生物顯微鏡和全色膠卷照相。

2 結果與分析

2.1 大蔥可育系花藥和小孢子發育過程的細胞學觀察

正常可育大蔥的花藥有4 個花粉囊， 呈蝶形， 花蕾橫切面呈三角形， 每一花蕾含有6 個花藥， 每一花藥4 室。一般將花藥發育過程分為造孢細胞期、小孢子母細胞期、四分體期、單核小孢子期、花粉粒成熟期。觀察表明， 大蔥同一花內的不同花藥或同一花藥的不同藥室， 小孢子母細胞減數分裂多不同步，可分別處于減數分裂各期或四分體期。同一藥室，小孢子母細胞減數分裂多為同步。

2.1.1 造孢細胞期花藥壁由4 種組織細胞層構成， 由外向內分別為表皮、藥室內壁、中層、絨氈層，其中絨氈層細胞核大， 細胞質濃， 著色深( 圖版1) 。

2.1.2 小孢子母細胞期早期花粉母細胞為多邊形， 細胞核大， 具有1 個明顯的大核仁且被染色較深， 初生壁上已產生胼胝質壁。隨著花粉母細胞逐步進入減數分裂， 其間的孢間層逐漸溶解， 細胞相互分開， 變成圓球形。此期的絨氈層細胞較大， 呈四邊形且狹長， 成圈狀規則排列在小孢子母細胞周圍， 有一些細胞為二核， 核大， 著色深且多核仁( 圖版2) 。此時中層細胞扁平， 多數中層細胞已解體斷裂。

2.1.3 四分體期減數分裂形成的四分小孢子由胼胝質所包圍， 形成左右對稱及十字交叉形的立體結構， 著色深( 圖版3) 。

2.1.4 單核小孢子期減數分裂后， 包裹著四分小孢子的胼胝質壁解體， 釋放出單個的小孢子。四分體小孢子分開時， 絨氈層細胞體積達最大。剛釋放出來的小孢子細胞壁很薄， 細胞核位居細胞中央( 圖版4) 。單核晚期， 花粉粒壁逐漸加厚且逐漸趨于圓球形， 著色較深， 分散于花粉囊中。此期， 絨氈層細胞開始自我解體。

2.1.5 花粉粒成熟期小孢子變圓， 絨氈層細胞消失， 成熟花藥的藥壁由表皮及具條紋加厚壁的藥室內壁組成( 圖版5) 。成熟后期， 花藥在抗拉力弱的僅由薄壁細胞組成的藥室內壁處縱向開裂， 使同側的2 個花粉囊相連通， 花粉沿裂縫散出。

2.2 大蔥不育系花藥和小孢子發育過程的細胞學觀察

大蔥雄性不育系小孢子母細胞的形態與減數分裂活動正常， 能形成正常的小孢子細胞， 而且絨氈層的活動在此期也沒有發生異常， 與可育系的絨氈層相似( 圖版6) 。但絕大多數小孢子不能進一步發育成雄配子體而開始敗育， 極少數可發育到二孢花粉初期或中期而敗育。小孢子敗育方式可分為以下2種類型:

2.2.1 敗育Ⅰ型花藥發育到單核小孢子時期， 組成花藥藥室的絨氈層像可育系一樣正常發育， 適時解體， 在成熟花粉粒時期完全解體。但中層細胞則存在延遲解體的現象， 在單核小孢子時期仍然存在，在小孢子外圍成1 圈。大部分的花藥壁極度收縮和解體的絨氈層融合在一起， 與中層細胞一起壓迫小孢子， 使之形成一染色極深的團塊狀物質( 圖版7) 。開花時， 藥室內壁細胞排列緊密不能像可育系一樣藥室開裂散放花粉， 使團塊狀小孢子存留在藥室內部。最終花藥癟縮變形， 各藥室扭曲極為嚴重。

2.2.2 敗育Ⅱ型在單核小孢子期以前， 絨氈層與正常花藥組織無異， 在四分體后期分泌出胼胝質酶來溶解包裹著減數分裂四分體的一層胼胝質壁， 釋放出單倍體小孢子。但在單核小孢子早期， 絨氈層提前解體， 不能持續提供小孢子發育所需的營養物質。從四分體中釋放出來的單核小孢子， 在早期即形成了明顯的花粉壁結構， 晚期單核小孢子得不到正常發育所需的足夠營養物質， 致使細胞質和細胞核相繼降解， 細胞質染色淡， 核仁很小， 到成熟時核仁消失， 僅剩下內空的花粉壁外殼。此時， 成熟花藥的藥壁由表皮及具條紋加厚壁的藥室內壁組成( 圖版8) 。在花粉粒成熟晚期， 花藥與可育系一樣在藥室內壁處縱向開裂， 花粉沿裂縫散出或者附著在花藥內壁上， 只是散出的花粉為內空的無生命活力的花粉粒( 圖版9) 。

3 討論

3.1 大蔥雄性不育系小孢子的敗育時期

Laser 等[7]在總結前人研究的基礎上提出: 植物雄性不育花藥的敗育可以發生在小孢子發育的每個時期， 雄性不育可能涉及不止一個機制; 單子葉植物花藥敗育多數在單核至雙核期， 雙子葉植物中大多數發生在四分體和小孢子形成期。席湘媛[8]曾報道大蔥的花粉敗育發生在具液泡的單核小孢子期早期， 這與本試驗的觀察結果有所差異。筆者觀察發現大蔥小孢子敗育多發生在單核小孢子晚期， 這也許是不同敗育類型之間有所差異。綜合前人研究和本試驗結果可以看出， 不同作物的雄性不育系小孢子敗育時期不同， 即使同一種作物， 其不同類型、不同來源的雄性不育系小孢子敗育時期也不盡相同，可能受外界環境的影響比較大。但是， 正如Laser 所說， 敗育發生在花粉發育的所有階段， 只是有些差異明顯， 有些差異不明顯， 不易觀察到。

3.2 有關花粉敗育原因的探討

關于植物雄性不育系小孢子的敗育原因， 許多學者從解剖學、細胞學與代謝角度， 通過小孢子發育的營養供給途徑等方面進行了探討， 大多數將其敗育歸因于絨氈層的異常[9- 12]。

植物絨氈層的已知功能至少有3 個[13]: ( 1) 給產生小孢子的組織及小孢子提供營養; ( 2) 分泌出胼胝質酶溶解包裹著減數分裂四分體的一層胼胝質壁，釋放出單倍體小孢子， 胼胝質酶的適時分泌在花粉發育中起著關鍵性的作用; ( 3) 產生生物合成花粉外壁的前體物。從本試驗觀察結果可以看出， 大蔥可育的正常花藥發育過程中， 在四分體形成期的絨氈層細胞質有濃縮的趨向， 染色最深， 核有時被覆蓋，這時多數為雙核。因此可得出結論， 四分體時期是積累營養的最佳時期， 這與席湘媛的研究結果一致14]。在單核小孢子時期， 絨氈層細胞適時解體， 及時提供花粉發育所需的營養物質并為花粉粒體積激增提供空間。而在大蔥雄性不育系花藥的發育過程中， 絨氈層細胞出現了提前或延遲解體的現象。

絨氈層細胞提早凋亡現象可能是由于絨氈層細胞的程序性死亡或細胞凋亡引起的[14]。這種程序化死亡過程如果紊亂， 會發生絨氈層細胞提早降解的現象， 最終導致小孢子在發育過程中不能從絨氈層獲得足夠的營養物質， 最后小孢子敗育; 但也可能是由于不育基因在小孢子發育成熟前， 通過調控絨氈層細胞行為， 使其提前降解， 并產生了一些信號物質， 使未成熟小孢子中的一些致死基因表達， 引起小孢子發育異常， 導致花粉敗育。但最終是不育相關基因致使絨氈層差異表達引起小孢子不能完成正常發育， 還是不育相關基因直接作用于小孢子， 引起其發育異常導致敗育， 還有待于進一步研究。

Chauhan[9]觀察到多種植物雄性可育系的藥室內壁的條紋狀加厚壁， 是在絨氈層細胞的原生質體徹底解體時發生的， 他支持De Fossard[15]關于絨氈層細胞內存在某種抑制藥室內壁形成條紋加厚壁的觀點。一些相應的雄性不育系及化學殺雄植物， 其絨氈層異常者， 藥室內壁均不產生條紋加厚壁， 他認為條紋加厚壁的形成， 受絨氈層的調控。本試驗觀察顯示， 敗育Ⅰ型花藥中， 絨氈層細胞未解體時藥室內壁也產生了條紋加厚壁， 這與De Fossard 及Chauhan的觀點有所不同。

在可育系花藥的發育過程中， 中層細胞內貯藏的物質漸漸被其消耗而減少， 同時由于受到花粉囊內部細胞增殖和長大所產生的擠壓， 中層細胞在四分體時期就解體而被吸收。而在本試驗中， 可觀察到一些雄性不育系花藥的中層細胞有延遲退化的現象， 在單核小孢子期仍然存在一起， 與內縮的藥壁組織壓迫小孢子成一團塊狀。而且存留的中層細胞可能阻隔了小孢子細胞與藥壁組織間的物質和信息交流， 導致小孢子敗育。關于小孢子敗育與絨氈層細胞的異常發育有緊密的聯系在許多文獻中都有報道， 但和中層細胞延遲解體有關系的則很少有報道。

參考文獻

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