氟桂利嗪對硝酸甘油致偏頭痛大鼠三叉神經核尾部Ｃ－ｆｏｓ蛋白表達的影響

摘要：目的觀察硝酸甘油(GTN)誘導的大鼠偏頭痛模型中大鼠三叉神經核尾部(TNC)C－fos蛋白的表達，以及氟桂利嗪(西比靈)對其表達的影響。方法 將24只Wistar大鼠隨機分為4組，即假手術組、對照組、西比靈治療組、西比靈預防組，用硝酸甘油10 mg/kg劑量皮下注射復制偏頭痛模型，用免疫組化SP法觀察C－fos蛋白表達的陽性細胞數、面積及灰度，并進行組間比較。結果對照組中三叉神經核尾部表達c－fos蛋白陽性細胞數較其余3組明顯增多。對照組C-fos蛋白陽性細胞數與假手術組及西比靈治療組比較均有統計學意義(P＜0.01)，但西比靈治療組、西比靈預防組與假手術組之間無統計學意義。結論 西比靈治療組和預防組均能顯著抑制C－fos蛋白的表達，其作用機制，可能是干預C－fos蛋白產生的某個環節，說明西比靈在治療和預防偏頭痛的發作過程中均起一定的作用。

關鍵詞：偏頭痛；西比靈；三叉神經核尾部；硝酸甘油

中圖分類號：R747.2 R255 文獻標識碼：A 文章編號：1672—1349(2007)04—0322—02

偏頭痛是臨床上常見的多發性疾病，世界衛生組織近來將偏頭痛歸類于20類致殘性最強的慢性疾病之一^[1]。大部分病人選用單一或聯合用藥來終止頭痛的發作，效果都不理想^[2]。本實驗通過觀察由硝酸甘油(GTN)誘導的偏頭痛模型中大鼠三叉神經核尾部(TNC)的C－fos蛋白的表達，以及氟桂利嗪(西比靈)對其表達的影響，以探討偏頭痛的發病機制及其藥物干預的效果，為臨床治療偏頭痛提供有效的藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar系健康封閉群大鼠24只，體重(220～250)g，由山西醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑及藥品兔抗大鼠C－fos抗體(博士德生物工程有限公司)，SP－9001免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)，西比靈(西安楊森制藥有限公司，批號041103779)，硝酸甘油注射液(北京益民藥業有限公司，批號20050909)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及造模將24只大鼠隨機分為為假手術組、對照組、西比靈治療組、西比靈預防組，每組6只。假手術組大鼠皮下注射生理鹽水1.04 mL/kg；對照組、西比靈治療組和西比靈預防組大鼠皮下注射硝酸甘油注射劑10 mg/kg，建立實驗性偏頭痛模型，以出現雙耳發紅、前肢頻繁撓頭、爬籠次數增多等提示模型動物頭部不適的癥狀為造模成功的指標。對照組造模30 min后灌胃蒸餾水1.04 mL/kg；西比靈治療組造模(15～20)min后灌胃西比靈1.04 mg/kg；西比靈預防組建立模型前灌胃西比靈1.04 mg/kg 1周。

1.3.2 灌注、固定、取材及切片造模4 h后，用1％戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉動物，仰臥固定，開胸，左心室插管入主動脈，剪開下腔靜脈。首先迅速灌注無菌生理鹽水200 mL。取大鼠腦組織，由延髓閂部向尾端行冠狀切取4 mm腦組織，放入甲醛液中固定24 h，后移入70％的乙醇中保存。常規脫水、石蠟包埋。石蠟切片機切片，4um 1張，共4張。

1.3.3 免疫組化石蠟切片行常規HE染色，顯微鏡下觀察確定組織結構未被破壞，進行免疫組織化學染色。室溫顯色，鏡下控制反應時間，(2～3)min后顯色充分。蒸餾水充分洗滌。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3.4

免疫組化對照實驗陰性對照：用PBS代替C－fos抗體，其他步驟與前述程序相同。

1.3.5

圖像定量分析在光學顯微鏡下，切片背景為淡黃或無色，陽性細胞呈黃棕色，多為圓形或卵圓形。采用病理圖像分析系統通過光學顯微鏡攝取圖像，輸入圖像分析系統內。對每張切片在TNC的部位隨機選取5個視野的數據。取其平均值進行比較。

1.4 統計學處理所有實驗數據用均數±標準差

表示，采用SPSS 13.0統計軟件分析，各組間比較用方差分析，其中兩兩比較用q檢驗。P＜0.05表示有統計學意義。

2 結 果

各組中C－fos蛋白陽性細胞為棕黃色染色。C－fos陽性細胞主要分布在兩側的TNC。陰性對照片無陽性信號出現，對照組中TNC的C－fos蛋白陽性細胞數較其余3組明顯增多。對照組與假手術組及西比靈治療組間比較均有統計學意義(P＜0.01)，西比靈治療組與假手術組、西比靈預防組與假手術組之間無統計學意義。詳見表1。

3 討 論

分布在皮膚、肌肉、關節和內臟器官中的傷害性感受器對傷害性刺激(初級感覺神經元的外周部分)如傷害性熱、強烈機械刺激和化學刺激均產生反應，刺激信息沿Aδ和C類纖維傳入背根神經節和TNC的神經元中，背根神經節和TNC的神經元將傷害性刺激的信息轉化成神經沖動(電活動)，經脊髓、腦干和丘腦的傳遞和調制，最后在大腦皮質產生痛覺。偏頭痛的發病機制就可能為某些傷害性刺激沿該途徑傳遞至腦干引起三叉神經血管系統痛覺敏感性增強而引發頭痛。

目前對引發偏頭痛發作的神經元解剖定位和其病理生理過程還不清楚，多數學者認為偏頭痛的發病機制是外周傷害性刺激激活中樞和外周的三又神經血管系統引發頭痛發作^[3]。由此可見三叉神經血管系統在偏頭痛的發生中起著非常重要的作用，化學或單側電刺激三叉神經節(UETGS^[4]或注射GTN后，分布在硬腦膜、結膜、眼瞼和口周的TNC末梢纖維釋放血管活性肽，如P物質(SP)、神經激肽A(NKA)和降鈣素基因相關肽(CGRP)。這些物質引起了血管內皮形成微絨毛和空泡(特別在硬腦膜靜脈后部毛細血管里)，肥大細胞脫顆粒、血小板集聚造成血管擴張和組織中的血漿蛋白外滲，激活自主神經系統出現結膜充血、流淚、流涕、惡心和嘔吐等癥狀。

本實驗采用硝酸甘油模型，通過導致腦膜血管擴張、神經源性炎癥形成及激活下丘腦、腦干及脊髓節段神經元功能等作用，引起二又神經纖維超敏既誘發頭痛^[5]。

GTN在血液內半衰期較短約(1～4)min。皮下注射GTN后，GTN在體內首先轉化為一氧化氮(NO)。NO是一種強力的內源性血管擴張劑和一種新型的逆行神經遞質，廣泛存在于中樞神經系統內。NO作用于血管周圍的一氧化氮能神經纖維(NO－ergic fiber)，產生神經源性血管擴張。NO還參與傷害性刺激的產生與傳遞，被認為是傳遞外周傷害性刺激的逆行性神經遞質^[6]。有研究表明NO對傷害性感受器有直接作用，體外單纖維記錄表明，皮膚感受野的灌流液中增加NO含量，引起傷害性感受器的發放，誘導感受器對機械性刺激的敏感性。傷害性刺激同時也能引起脊髓背角神經元釋放NO，注射GTN后，三叉神經核尾部NOS神經元的活性增加^[7]，使體內NO形成增多。

同Offenhauser等^[8]的實驗結論一致，本組實驗中，觀察到在注射GTN 4 h后，TNC的神經元表達C－fos蛋白，對照組與假手術組、西比靈治療組比較均有統計學意義(P＜0.01)，西比靈治療組、兩比靈預防組與假手術組之間無統計學意義。西比靈減少TNC的C－fos表達可能為其能夠緩解頭痛的機制之一。

本實驗中，西比靈治療組、西比靈預防組和對照組在3 min左右出現前肢頻繁撓頭、爬籠。前肢頻繁撓頭、爬籠次數在(30～60)min，3組比較無明顯的差別，在1 h后西比靈預防組、西比靈治療組和模型組比較，大鼠前肢頻繁撓頭，爬籠次數減少。說明兩比靈不能減輕由NO引起的血管擴張。Ciancarelli等^[9]實驗結果也說明西比靈不能防止NO介導的血管舒張。西比靈治療偏頭痛可能有多種作用途徑。

西比靈是新型的長效非選擇性的T型、N型、L型鈣通道阻滯劑^[10，11]。西比靈治療偏頭痛作用機制在于阻斷細胞膜和神經纖維上的鈣通道，抑制Ca²⁺內流使處于痙攣期的血管擴張，改善腦部供血供氧，用于治療偏頭痛。腦部單光子發射斷層顯像(SPECT)和磁共振成像(MRI)均顯示普通偏頭痛病人左側額葉、頂葉、枕葉部和右側枕部的血灌注量下降^[12，13]。經過西比靈治療后，大腦中動脈、大腦前動脈的收縮期峰值流速減慢，血管擴張，減少偏頭痛的發作次數和頭痛程度^[14]。實驗證明西比靈可能是通過阻斷脊髓背角第1層、第Ⅱ層N型Ca²通道和抑制NMDA受體的激活，增強神經元細胞膜的穩定性，減少TNC神經元對外界的傷害性刺激敏感性及減少NO的合成，發揮防治偏頭痛的作用。

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作者簡介：郝嘉楠(1980—)，男，畢業于山西醫科大學大同學院，現為山西醫科大學第一醫院神經內科在讀碩士研究生(郵編：030001)；牛爭平，工作于山西醫科大學第一醫院。

(本文編輯 郭懷印)

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