干細胞的定向分化及中藥干預的研究現況

中圖分類號：R285 文獻標識碼：A 文章編號：1672—1349(2007)04—0331—03

干細胞是一種具有無限自我復制能力和向多種細胞分化潛能的細胞?，F在被廣泛研究的有胚胎干細胞和骨髓干細胞，前者指早期胚胎的多能于細胞(pluripotent cell)，后者指存在于骨髓中的具有多向分化潛能和自我更新能力的干細胞。目前認為骨髓中至少含有兩種干細胞：造血干細胞(hematopietic stemcell，HSC)和間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)。近幾年來將干細胞定向分化的神經細胞或神經前體細胞移植治療神經系統疾病受到了廣泛的關注，成為臨床和實驗研究的熱點之一。因此如何將胚胎干細胞和骨髓干細胞定向分化為神經細胞或神經前體細胞是研究的關鍵所在?，F主要就干細胞定向分化為神經細胞及中藥干預的研究現況作一綜述。

1 干細胞向神經細胞的定向分化

1.1 胚胎干細胞向神經細胞的定向誘導分化方法 目前胚胎干細胞定向分化的方法大致分為以下3類：①體外誘導法，此種方法很多，也是最為常用的，包括維A酸(維甲酸，RA)誘導、基質細胞源性的誘導活性、生長或分化因子誘導、按譜系限制性發育控制基因的方向進行分化等。其中華盛頓大學醫學院Bain等^[1]的維甲酸4－/4＋誘導法被視為最基本的，也是最經典的神經細胞誘導方法。雖然維甲酸是胚胎干細胞向神經細胞分化的有效誘導劑，但維甲酸誘導無法排除雜細胞的存在，且誘導后的神經細胞不能增殖，存活時間也短^[2]。而譜系選擇法誘導的神經前體細胞可以彌補這些缺陷，它使胚胎干細胞經歷了胚胎干細胞－類胚體神經前體細胞終末類型細胞4個過程，較之維甲酸誘導法可能更接近于胚胎正常發育過程。因此，在胚胎干細胞移植研究領域，采用譜系選擇法誘導出神經前體細胞進行移植將是一種趨勢^[3]。②導人外源性基因，使其分化為某一特定類型的細胞。③體內定向分化，使胚胎干細胞多數分化為該組織特異性的細胞。胚胎干細胞移植人體內后的遷移方向和分化的細胞類型受局部微循環的影響。

為找到胚胎干細胞定向分化的最佳條件，郭雨霽等^[4]將從小鼠胚泡內細胞團中獲取的胚胎干細胞進行體外培養，通過向培養液中分別加入維甲酸、大腦皮質細胞條件培養液＋維甲酸、β－巰基乙醇＋維甲酸＋大腦皮質細胞條件培養液，觀察胚胎干細胞向神經細胞方向分化的情況。結果發現用維甲酸、β－巰基乙醇和大腦皮質細胞條件培養液聯合誘導胚胎干細胞，可使70％以上的胚胎干細胞分化為神經元特異性烯醇化酶免疫陽性的神經細胞。并且認為聯合應用對胚胎干細胞的誘導分化有明顯的互補和協同作用。

1.2 骨髓干細胞向神經細胞的定向誘導分化方法定向分化為神經細胞的骨髓干細胞是指骨髓間充質干細胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSC)，又稱為骨髓基質(干)細胞，簡稱骨髓干細胞。BMSC在合適的體外環境中可長期生長，呈成纖維樣細胞表型，可誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞、骨髓基質細胞、血管內皮細胞、肝細胞和神經細胞等^[5，6]。BMSC具有來源廣泛、分離培養容易、多向分化能力、易被外源性基因轉染、植入反應低及無成瘤性等特點^[7]。雖然當前分離純化培養BMSC的方法很多，但骨髓細胞是一群異質細胞，成分復雜，BMSC缺乏特異標記分子。如何進一步對BMSC進行分離純化，仍是一個亟須解決的課題^[8]。

BMSC向神經細胞的定向分化研究主要也分體外培養和體內分化兩部分。體外實驗主要是在體外培養基中加入抗氧化劑或者生長因子以誘導分化。如姜曉丹等^[9]采用梯度密度離心法分離獲取成人骨髓源細胞，“CYTOKINE·神經干細胞培養液”培養主要含有細胞因子：膠質源性神經營養因子(GDNF)(20ng/mL)、維甲酸(0.5 ug/mL)、LIF(10 ng/mL)等，發現成人骨髓源細胞在相應培養條件下快速分裂增殖為大而圓并含粗大胞質顆粒的神經干細胞。Iblack等^[10]。報道骨髓干細胞能夠在β－巰基乙醇、二甲基亞砜、3－叔丁基－4羥基茴香醚等抗氧化劑的誘導下分化為神經細胞。施雪英等^[11]從大鼠股骨中分離、貼壁法體外擴增、傳代培養骨髓干細胞，以二巰基乙醇(2－ME)預誘導，再加入2－ME、3－叔丁基－4羥基茴香醚誘導。結果也證實2－ME、3－叔丁基－4羥基茴香醚在體外能夠有效的誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為神經元樣細胞。汪泱等^[12]將大鼠骨髓間充質干細胞分離培養后，采用阿魏酸鈉對其進行誘導培養，結果發現阿魏酸鈉誘導培養6 h后即可見細胞形態發生明顯變化，24 h后表現為典型的神經細胞樣形態，神經細胞特異性標志物呈陽性表達。

骨髓干細胞能夠在體內分化為神經細胞，這些細胞具有廣泛遷移和位置依賴性。目前大多數體內移植的研究都是將分離的骨髓于細胞直接移植到紋狀體、側腦室等部位，如Azizi等^[13]將BMSC注射到大鼠腦內紋狀體區后，約20％的細胞成功存活并沿已知的神經干細胞遷移路徑進行整合、遷移。

將5溴－2脫氧尿苷(Br－du)標記的小鼠BMSC注射到3日齡胎鼠側腦室，12 d后BMSC遷移到前腦和小腦而未破壞宿主的正常腦結構，部分分化為具有星形膠質細胞形態、表達GFAP的細胞；有些BMSC出現于神經元富集的區域如嗅球和小腦的內顆粒層甚至腦干網狀結構，并向神經元分化^[14]。Chen等^[15]將Brdu標記的大鼠骨髓(BM)細胞和腦源性神經營養因子(BEINF)一起移植到MCAO大鼠的腦缺血邊緣區，可見Brdu陽性細胞表達NeuN和GFAP，腦內移植BM＋BDNF組較對照組運動和軀體感覺顯著改善。

2 中藥干預干細胞定向分化的實驗研究

目前雖然中藥干預胚胎干細胞分化的研究尚沒有報道，但是已有很多中藥干預神經干細胞分化和骨髓干細胞定向分化的報道?，F將目前有關此方面研究的現狀進行總結。

中藥促進干細胞分化的研究分為兩方面：一方面是利用有清熱瀉火、活血化瘀等藥效的單種中藥提取物來體外誘導神經干細胞分化，如張艷君等^[16]報道黃芩苷、梔子苷能誘導神經干細胞特異性分化成非成熟神經元，而聯合應用補氣中藥提取物黃芪苷、活血化瘀中藥提取物三七總皂苷能明顯提高成熟神經元的比例。提出了不同治則中藥針對損傷后神經再生不同階段干預促進神經元再生的概念。陳東等^[17]發現鹿茸多肽在體外可明顯促進神經干細胞向神經元分化。陳東風等^[18]采用大腦中動脈線拴法造成局灶性腦缺血大鼠模型，應用免疫組織化學技術檢測神經上皮干細胞蛋白(Nestin)的表達，觀察龜板對腦缺血后神經上皮干細胞蛋白的影響。結果表明龜板可降低神經病評分和增強腦缺血后Nestin的表達。提示補腎中藥龜板可減輕神經損傷癥狀和對局灶性腦缺血后神經干細胞有促進增殖作用。沈驊睿等^[19]用仙茅水提物對大鼠骨髓間質干細胞進行刺激，經RT－PCR和免疫細胞化學染色檢測、倒置顯微鏡下觀察使用中藥仙茅水提物誘導刺激后的大鼠骨髓間質干細胞的變化情況，結果RT－PCR檢測有神經元細胞和神經膠質細胞的特異性蛋白神經元烯醇酶和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)表達，倒置顯微鏡下觀察到有神經元樣細胞生長，免疫細胞化學染色檢測有神經元細胞和神經膠質細胞著色。因此認為中藥仙茅水提物能定向誘導骨髓干細胞向神經元細胞分化。并發現在未加任何誘導藥物的骨髓間質干細胞對照組中也檢測到有神經元特異性烯醇化酶(NSE)和GFAP的mRNA表達，分析認為導致這種未誘導的體外神經分化的原因是體外的血清環境和培養液中的高糖環境導致的。王勇等^[20]利用梯度離心從大鼠骨髓中分離單核細胞進行培養，去除不貼壁的細胞，分離純化，對其生長特性進行分析。采用含黃芪的無血清L－DMEM誘導分化為神經細胞樣細胞，觀察細胞形態變化，用免疫組織化學方法檢測分化細胞中巢蛋白(nestln)、NSE、GFAP的表達。結果發現經黃芪誘導后，骨髓間充質干細胞形態發生改變，nestln、NSE和GFAP陽性，分化為神經元或膠質細胞樣細胞。采用含丹參注射液或硫代甘油誘導BMSC分化為神經元，可能與丹參中含有丹參酮、總丹酚酸等多種抗氧化成分有關^[21]。

另一方面是應用血清藥理學原理，利用復方中藥血清促進神經干細胞的分化，如楊萍等^[22]將不同濃度的肌萎靈注射液加入含5％胎牛血清的DMEM/F12的細胞培養液中，制成培養液，與用含5％胎牛血清的DMEM/F12稀釋的力如太(終濃度為10 umol/L的培養液)作對照，觀察二者對培養的神經干細胞的誘導分化能力。結果表明肌萎靈注射液和力如太均能能促進神經于細胞向神經元方向的分化，并且當肌萎靈注射液的濃度為1％時，其誘導能力最強。肌萎靈注射液與力如太相比較也有顯著性的差異。劉伯炎等^[23]觀察了中藥腦溢安顆粒對腦出血后神經干細胞反應的影響，發現腦出血后nestin陽性細胞增多，1 d達高峰，然后逐漸降低，維持到第7天，nestin陽性細胞主要分布在海馬、皮質區。腦溢安組與模型組3 d后各時間點存在顯著性差異，能夠維持被激活的神經干細胞的增殖。

劉伯炎等^[24]還觀察了中藥補陽還五湯對大鼠局灶性腦缺血后內源性神經干細胞反應的影響，發現正常大鼠腦組織中存在少量的神經干細胞(NSC)，主要分布在皮質區，腦缺血后NSC增殖，以皮質、缺血周圍區增加明顯，健側海馬區可見NSC啟動，1 d開始增多，5 d達到高峰。補陽還五湯組與模型組比較在5 d、7 d存在明顯差異，更能促進并維持NSCs的增殖。

3 問題與展望

干細胞移植治療各種疾病近年來受到了廣泛的關注，胚胎干細胞和骨髓干細胞的定向分化也成了研究的熱點之一。雖然實驗技術和方法現在得到了很大的改進，但是在很多方面都存在問題，如胚胎干細胞的來源、定向分化的方法的選擇、移植后免疫排斥的問題等。自體骨髓干細胞移植雖然能解決胚胎干細胞的來源困難、免疫排斥的問題，但是骨髓干細胞的分離純化困難、表達率低等也是迄待解決的關鍵所在。中藥干預的研究興起較晚，目前也僅是局限于體外實驗研究階段，不管是單藥提取還是復方制劑在體外培養都脫離了人體環境，這違背了中醫整體觀念和辨證論治的思維方法。但是干細胞的移植還是為臨床實踐帶來了希望，目前骨髓干細胞治療遺傳變性疾病已取得了可喜的成果。

參考文獻：

[1] Bain G，Kitchens D，Yao M，et al． Embryonic stem cells express neu-ronal properties in vitro[J]．Dev Bio，1995，168(2)：342—357．

[2] Dinsmore J，Ratliff J，Deacon T，et al Embryonic stem cells differenti-ated in vitro as a novel．source of cells for transplantation [J]．CellTrans，1996，5(2)：131—141．

[3] 薛亞梅，王鋒胚胎干細胞向神經細胞定向誘導分化方法的研究進展[J]．中國畜牧雜志，2005，4l(8)：58—60．

[4] 郭雨霽，高英茂，邴魯軍，等．胚胎干細胞向神經細胞定向誘導分化的研究[J]．解剖學報，2003，34(2)：168—171．

[5] Bianco P，Riminucci M，Gronthos S，et al．Bonemarrow stromal cells：Nature，biology，and potential applications[J]．Stem Cells，2001，19：180—192．

[6] 戴宜武，徐如祥，姜曉丹，等骨髓基質細胞休外誘導分化成神經元和膠質細胞[J]．解剖學研究，2002，24：3—5．

[7] van Damme A，Vanden Driessche T，Collen D，et al．Bone marrowstromal cells as targets for gene therapy[J]．Curr Gene Ther，2002，2(3)：195—209．

[8] 裴雪濤．干細胞生物學[M]．北京：北京科學出版社，2003：107—109．

[9] 姜曉丹，徐如祥，張世忠，等．成人骨髓源性神經干細胞誘導分化實驗研究[J]．解放軍醫學雜志，2002，27(11)：947—951．

[10] lblack IB，Woodbury D Adult rat and human bone marrow stromalstem cells differentiate into neurons[J]．Blood Cells Mol Dis，2001，27(3)：632—636．

[11] 施雪英，陳先文，任于果，等．大鼠骨髓間充質干細胞在體外向神經元樣細胞的分化[J]．安徽醫科大學學報，2006，41(1)：16—18．

[12] 汪泱，鄧志鋒，賴賢良，等．阿魏酸鈉誘導骨髓間充質干細胞向神經細胞分化的初步研究[J]．中草藥，2004，35(3)：290—292．

[13] Azizi SA，Stokes D，Augelli BJ，et al．Engraftment and migrauon ofhuman bone marrow stronml cells implanted in the brains of albinorats－similarities to astrocyte grafts[J]．Proc Natl Acad Sci，1998．95：3908—3913．

[14] Kopen GG，Prockop DJ，Phinney DG．Marrow stromal cells migratethroughout forebrain and cerebellum，and they differentiate into as-trocytes after injection into neonatal mouse brains[J]．Proc Natl Acadsci，1999，96：10711—10716．

[15] Chen JL，Li Y，Chopp M Intracerebral transplantation of bone mar-row with BDNF after MCAo in rat[J]．Neuropharmacology，2000，39：7Il 716．

[16] 張艷君，范祥，胡利民，等．不同治則中藥單體對體外培養神經干細胞分化的影響[J]．滅津中醫藥，2004，21(2)：156—157．

[17] 陳東，孟曉婷，劉佳梅，等．鹿茸多肽對胎大鼠腦神經干細胞體外誘導分化的實驗研究[J]．解剖學報，2004，35(3)：240—243．

[18] 陳東風，杜少輝，李伊為，等．龜板對局灶性腦缺血后神經干細胞的作用[J]．廣州中醫藥大學學報，2001，18(4)：328—331．

[19] 沈驊睿，呂文科，楊松濤．中藥仙茅對骨髓干細胞向神經元細胞定向誘導的實驗研究[J]．成都中醫藥大學學報，2005，28(4)：8—11．

[20] 王勇，陸長青，王凡．黃芪誘導大鼠骨髓間充質于細胞分化為神經樣細胞的研究[J]．四川解剖學雜志，2006，14(1)：5—8．

[21] 項鵬，夏文杰，王連榮，等．丹參注射液誘導間質干細胞分化為神經元樣細胞[J]．中山醫科大學學報，2001．22：321—324．

[22] 楊萍．王繼明，應大君，等．中藥制劑——肌萎靈注射液對神經干細胞的促分化作用[J]．神經解剖學雜志，2005，21(2)：171—174．

[23] 劉伯炎，黎杏群，張化先，等．腦溢安顆粒對實驗性大鼠腦出血后神經干細胞增殖的影響[J]．中國l臨床康復．2003，7(25)：3428—3429．

[24] 劉伯炎，蔡光先，林琳，等．補陽還五湯對大鼠局灶性腦缺血后神經干細胞影響的初步研究[J]．中國臨床康復，2004，8(22)：4532—4533．

作者簡介：臧志萍(1978—)，女，現為山東中醫藥大學2004級中醫神經內科專業在讀博士研究生(郵編：250014)；曹曉嵐，工作于山東中醫藥大學附屬醫院。

(本文編輯 郭懷印)