腦心通膠囊對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷及ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９表達的影響

摘要：目的觀察腦心通膠囊對大鼠局灶性腦缺血再灌注腦組織病理變化及MMP－2、MMP－9表達的影響，并探討其可能的保護機制。方法建立大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型，應用HE及S－P免疫組化法分別觀察模型組及用藥組大鼠全腦組織的病理改變及MMP－2、MMP－9表達的變化。結果假手術組大鼠腦組織形態(tài)結構正常，MMP－2、MMP－9見少量散在陽性表達或不表達；模型組大鼠大腦缺血再灌注區(qū)組織明顯水腫、蛻變、壞死伴少量炎細胞浸潤，對側大腦相應區(qū)及雙側小腦輕度水腫，MMP－2、MMP－9表達較假手術組對應區(qū)顯著升高(P＜0.01或P＜0.05)，其中缺血側大腦以壞死區(qū)邊緣腦組織表達為甚，且較對側大腦及雙側小腦明顯升高(P＜0.05)；腦心通用藥組大鼠大腦缺血區(qū)組織水腫、蛻變、壞死較模型組明顯減輕，對側大腦相應區(qū)及雙側小腦腦組織形態(tài)結構正常，MMP－2、MMP－9表達較模型組對應區(qū)顯著降低(P＜0.05)。結論腦心通膠囊對大鼠局灶性腦缺血再灌注后包括病灶在內的全腦損傷有保護作用，其作用機制可能與降低MMP－2、MMI－9表達有關。

關鍵詞：腦缺血；再灌注；腦心通膠囊；免疫組織化學；大鼠

中圖分類號：R743.31 R285.6 文獻標識碼：A 文章編號：1672一1349(2007)04—0328—03

腦缺血再灌注后可出現(xiàn)腦水腫，加重因缺血、缺氧引起的神經(jīng)細胞損傷，并導致顱內壓增高、腦疝等并發(fā)癥，是中風病人早期死亡的重要原因。再灌注損傷涉及到多方面的機制，近幾年研究發(fā)現(xiàn)^[1]，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)尤其是其中的明膠酶(MMP－2、MMP－9)表達的異常是腦缺血再灌注損傷的重要機制。臨床實踐表明腦心通在腦缺血再灌注損傷治療中有較好的療效，但其確切機制尚不明^[2]。鑒于此，本研究旨在建立大鼠腦缺血2 h再灌注24 h模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)后，通過觀察缺血再灌注組及腦心通用藥組大鼠腦組織的病理組織學改變及MMP－2、MMP－9表達的變化以探討腦心通在腦缺血再灌注損傷中的可能作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 取健康成年Sprague Dawley雄性大鼠45只，體重250 g～300 g，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心(皖醫(yī)室動第0l號)。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(23～25)℃，濕度60％～70％，自然光照，復合顆粒飼料，自由飲水。將大鼠隨機分成3組：假手術組(5只)、模型組(20只)、腦心通組(20只)。

1.2 試劑兔抗鼠MMP－2單抗、免抗鼠MMP－9單抗、S－PKit及DAB顯色試劑均購自北京中山生物技術有限公司(除S－P Kit為美國Zymed公司產(chǎn)品外，其余均系美國Santa－Cruz公司產(chǎn)品)。

1.3 動物模型制作參照Zcalonga等^[3]法，以10％的水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，頸部正中切口，逐層分離暴露右側頸總動脈，靠近心端結扎，遠心端做切口置人2－0魚線(頭端加熱呈直徑約0.3 mm的圓球形)，插入約18 mm～20Hm(距頸總動脈分叉處)，魚線。逐層縫合切口，魚線殘端留置切口外約5 mm。再灌注時，將魚線拔出約10 mm。模型成功的標志是術后動物出現(xiàn)同側Homers征及動物麻醉清醒后出現(xiàn)以左前肢為主的偏癱。給藥途徑：腦心通治療組給予腦心通藥液灌胃(2 g/kg；給藥容積0.5 mL/100 g，每天1次，連續(xù)5 d)，于第5天灌胃1 h后手術制備局灶腦缺血再灌注模型(同上述模型組)，假手術組與模型組給予等量的生理鹽水。再灌注24 h后，斷頭取腦，大腦、小腦均行冠狀切面取材，其中大腦在以視交叉為中心處冠狀切面取材。假手術組大鼠不作缺血處理，也不予藥物治療，取材部位同上。

1.4 病理形態(tài)學 上述取材腦標本10％中性甲醛固定，石蠟包埋，5 um連續(xù)切片數(shù)張，其中1張行HE染色，其余作免疫組化檢測之用。

1.5 S－P免疫組織化學法組織切片先行煮沸抗原修復，具體操作按說明書進行，一抗稀釋度為MMP－2(1:150)、MMP－9(1:120)，最后蘇木精復染。陽性對照為已知的MMP-2、MMP－9陽性切片；陰性對照為用PBS代替一抗。陽性信號為棕黃色。陽性計數(shù)：結合HE圖像相應區(qū)，各組每只大鼠相應部位均選1張切片，高倍鏡下取10個視野，數(shù)陽性細胞數(shù)及陽性血管數(shù)，然后取各組平均值。

1.6 統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差

表示，各組間比較采用γ²檢驗及t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 病理組織學改變 5只假手術組大鼠無1例死亡，40只造模大鼠中除模型組死亡3例，用藥組死亡2例外，其余均成功。HE染色后，假手術組大鼠大、小腦組織形態(tài)、結構正常。模型組大鼠右側大腦缺血區(qū)神經(jīng)元及膠質細胞明顯減少，殘存神經(jīng)元固縮蛻變，間質高度水腫，少量炎細胞浸潤，缺血邊緣區(qū)腦組織明顯水腫，見少量格子細胞。左側大腦對應區(qū)及雙側小腦呈較輕的水腫改變。腦心通用藥組大鼠右側大腦缺血區(qū)神經(jīng)元及膠質細胞蛻變、間質水腫及炎細胞浸潤較模型組明顯減輕，左側大腦對應區(qū)及雙側小腦未見明顯異常。

2.2 免疫組織化學結果(見表1) 在假手術組大鼠的雙側大小腦組織MMP－2、MMP－9見少量散在陽性表達或不表達，其中MMP－2陽性表達略高，陽性定位主要在血管內皮細胞及星形膠質細胞胞質、胞膜中。模型組大鼠雙側大小腦組織MMP－2、MMP－9表達較假手術組對應區(qū)域顯著升高。其中缺血側大腦又較對側大腦及雙側小腦明顯升高(P＜0.05)。陽性表達除定位于血管內皮細胞、星形膠質細胞胞質、胞膜外，也見于神經(jīng)元、小膠質細胞及炎細胞。從組織水平分布上，缺血側大腦組織以壞死蛻變區(qū)的邊緣腦組織陽性表達為甚，對側大腦則呈較均勻的散在陽性表達，雙側小腦中均以Ⅳ腦室附近白質的微小血管表達較明顯，其次是小腦皮質神經(jīng)元。腦心通組大鼠雙側大小腦組織MMP－2、MMP－9表達較模型組對應區(qū)域顯著降低。

3 討 論

現(xiàn)代神經(jīng)科學認為^[4]，神經(jīng)細胞、膠質細胞微血管內皮細胞間的相互依存關系是組成和維持腦功能及結構的必要條件，血腦屏障參與血腦物質交換的調節(jié)，而神經(jīng)元的直接生存微環(huán)境是神經(jīng)元和膠質細胞間的細胞間液即細胞外基質(ECM)。腦組織中ECM是維持血腦屏障(BBB)結構完整性的重要組成部分，其中基底膜尤為重要，它由ECM分子如Ⅳ型膠原、層黏蛋白和纖維連接蛋白構成，為血管的完整性提供結構支持^[5]。基質金屬蛋白酶是一組含鋅酶的基因家族，其家族中的明膠酶即MMP－2(明膠酶A)和MMP－9(明膠酶B)有一個纖黏蛋白結合域，可降解ECM、破壞腦血管外基底膜主要成分(黏蛋白和纖黏蛋白)從而破壞血腦屏障、改變毛細血管通透性導致血管源性腦水腫甚至出血性轉化。

本實驗中，首先病理形態(tài)學檢測結果顯示假手術組腦組織結構正常；缺血再灌模型組大鼠缺血區(qū)腦組織明顯水腫、退變壞死，說明造模成功。其次，MMP－2、MMP－9在假手術組不表達或僅少量陽性表達，與文獻報道基本一致^[6，7]。而模型組大鼠腦組織MMP－2、MMP－9表達均較假手術組對應區(qū)域顯著升高，其中尤以缺血側大腦為甚；此與Rosenberg等^[8]用細胞培養(yǎng)及免疫組化檢測的結果基本一致。這表明MMP－2、MMP－9在缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要作用，結合模型組大鼠腦組織較假手術組呈明顯水腫改變及MMP－2、MMP－9本身生物學功能，提示MMP－2、MMP－9參與損傷的部分機制是通過降解ECM尤其血管基底膜、破壞血腦屏障、引起血管源性腦水腫。新近國外有文獻^[9]報道，在MCAO腦缺血再灌注損傷中檢測到MMP－2、MMP－9明顯升高的同時伴有Ⅳ型膠原、層剩蛋白等ECM含量的下降，這為上述推論提供了證據(jù)。

本研究顯示，腦心通治療組大鼠缺血再灌注后其組織學損傷較模型組明顯減輕，這說明腦心通對大鼠缺血再灌注后腦損傷有保護作用。與此同時，相應的MMP－2、MMP－9表達也較模型組顯著降低則進一步提示腦心通可能通過下調MMP－2 MMP－9表達這一機制來對抗缺血再灌注損傷而發(fā)揮其保護作用的。而要完全證實則有待于進一步檢測血腦屏障中Ⅳ型膠原、層黏蛋白和纖維連接蛋白等ECM的變化。

近幾年臨床和動物實驗的研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死急性期，除病灶側外，在遠離病灶的部位也出現(xiàn)血流及代謝的改變，臨床上則表現(xiàn)為各種不同類型的神經(jīng)機能聯(lián)系不能，其形成機制目前認為可能與血流動力學改變及神經(jīng)傳導通路的抑制有關，但具體確切機制尚不明。Lzumi等^[10]采用MCAO模型動態(tài)觀察大腦中動脈阻塞后3 h、6 h、9 h和24 h冠狀位大腦MRI的信號，發(fā)現(xiàn)MRI異常信號的出現(xiàn)除分布在MCA供血區(qū)外，還涉及同側大腦半球MCA供血區(qū)之外的海馬、梨狀葉以及對側大腦半球，并提示遠隔部位異常信號為水腫。這表明MCAO模型可用于研究神經(jīng)機能聯(lián)系不能且腦水腫可能是其病理變化之一。Heo等^[11]曾對27例非人類靈長類動物MCA缺血再灌注后，缺血區(qū)及非缺血區(qū)基底核進行了冰凍組織切片和血漿標本MMP－2、MMP－9的檢測，結果顯示二者均有局部表達及血漿水平的升高。本實驗結果顯示模型組大鼠非缺血側腦組織較假手術組有輕度水腫，且MMP－2、MMP－9表達顯著高于假手術組，與上述Heo等^[11]結果較一致，進一步提示MMP－2、MMP－9可能是通過引起腦水腫參與了局灶性腦梗死繼發(fā)全腦損害的形成機制，繼而臨床上表現(xiàn)出神經(jīng)機能聯(lián)系不能。腦心通治療組大鼠非缺血側腦組織的組織學改變及MMP－2、MMP－9表達則與假手術組無差異，這表明腦心通可通過抑制遠隔部位腦組織MMP－2、MMP－9過度表達減輕遠隔部位腦水腫進而減輕神經(jīng)機能聯(lián)系不能。

腦心通通過抑制腦組織MMP－2、MMP－9的表達不僅可減輕病灶組織的腦缺血再灌注損傷而且可減輕遠隔部位腦水腫，表明腦心通治療作用之外尚存在全腦的保護作用。

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作者簡介：余鋒，現(xiàn)工作于安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院(郵編：230001)：胡向陽、董六一，工作于安徽醫(yī)科大學；王文靜、李淮玉、任明山，工作于安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院。

(本文編輯 郭懷印)

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文”