脂欣康膠囊對載脂蛋白Ｅ基因敲除小鼠ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β干預(yù)作用

摘要：目的觀察脂欣康膠囊對載脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠血清腫瘤壞死因子α(TNF－α)和白細(xì)胞介素1β(IL－1p)的影響。方法將6周齡ApoE基因敲除小鼠隨機(jī)分為模型組與脂欣康組，相同遺傳背景的同齡正常C57BL/6J小鼠為正常對照組。脂欣康組灌服脂欣康膠囊內(nèi)之藥粉，模型組、正常對照組均灌服生理鹽水。連續(xù)灌胃2周后(8周齡)，各組隨機(jī)取出半數(shù)小鼠，雌雄各半，麻醉后由腹腔靜脈抽血。另一部分繼續(xù)灌胃4周后(12周齡)由腹腔靜脈抽血。離心分離血清，ELISA法檢測TNF－α和IL－1β。結(jié)果灌服2周后，脂欣康組小鼠血清TNF－α和IL－1β顯著低于模型組(P＜0.05)，模型組顯著高于正常對照組(P＜0.05)；繼續(xù)用藥4周后，TNF－α和IL－1β無明顯增高，脂欣康組顯著低于模型組(P＜0.05)，模型組顯著高于正常對照組(P＜0.05)。結(jié)論脂欣康膠囊具有顯著抑制ApoE基因敲除小鼠血清TNF－α與II－1β增高的作用。

關(guān)鍵詞：脂欣康膠囊；載脂蛋白E；基因敲除小鼠；腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素－1β

中圖分類號：R543.5 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672—1349(2007)04—0312一02

美國科學(xué)家1992年利用基因打靶與胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)基礎(chǔ)上的基因敲除(gene knockout)技術(shù)培育成功的載脂蛋白E(AImE)基因敲除小鼠，在正常飲食下即可形成明顯的高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化(AS)病灶，成為研究AS發(fā)病機(jī)制和干預(yù)措施的較理想的動(dòng)物模型^[1－3]。脂欣康膠囊對高脂血癥和不穩(wěn)定型心絞痛有顯著療效，并具有保護(hù)血管內(nèi)皮和抗AS等作用^[4]。本研究應(yīng)用ApoE基因敲除小鼠這種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，探討中藥復(fù)方脂欣康膠囊對腫瘤壞死因子α(TNF－α)和白細(xì)胞介素1β(IL－1β)的作用，為該制劑用于臨床防治AS及相關(guān)疾病的機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料脂欣康膠囊由濟(jì)南孟氏生物科技研究所有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：衛(wèi)食健字(2001)第0010號，批號：20051006。6周齡ApoE基因敲除小鼠20只，雌雄各半，體重(20±2)g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物科技部從美國Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)繁育。相同遺傳背景的6周齡C57BL/6J小鼠20只，雌雄各半，體重(20±2)g，北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。TNF－α和IL－1β的ELISA檢測試劑盒購自Biosource公司。

1.2 動(dòng)物分組及給藥方法將40只6周齡ApoE基因敲除小鼠隨機(jī)分為兩組：模型組與脂欣康組各20只。相同遺傳背景的6周齡正常C57BL/6J小鼠20只為正常對照組。各組動(dòng)物均喂飼SPF級普通飼料。模型組及正常對照組均灌服生理鹽水0.4mL，脂欣康組灌服脂欣康膠囊內(nèi)的藥粉每日每只0.008 g。連續(xù)灌胃2周后(8周齡)，各組隨機(jī)取出半數(shù)小鼠，雌雄各半，麻醉后由腹腔靜脈取血。另外半數(shù)小鼠繼續(xù)灌胃4周后(12周齡)由腹腔靜脈取血。離心分離血清，放入－20℃冰箱保存。TNF－α和IL－1β檢測按照ELISA試劑盒說明書嚴(yán)格執(zhí)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理檢測數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件處理。各組均數(shù)采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

模型組小鼠血清TNF－α、IL－1β含量較正常對照組顯著增高(P＜0.05)；脂欣康組小鼠血清TNF－α、IL－1β較模型組顯著降低(P＜O.05)。脂欣康組給藥2周和6周比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表1。

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化曾被認(rèn)為是一個(gè)緩慢的脂質(zhì)積聚過程。自從Ross等^[5]提出動(dòng)脈粥樣硬化的損傷反應(yīng)學(xué)說后，越來越多的證據(jù)提示動(dòng)脈粥樣硬化過程是一個(gè)血管受損傷后的炎癥反應(yīng)過程。炎癥反應(yīng)貫穿了動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的過程。TNF－α主要是巨噬細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，其他類型的細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等在慢性炎癥刺激下也具有產(chǎn)生和釋放TNF－α的能力^[5]。由于TNF－α可引起細(xì)胞壞死、血栓形成和新生血管形成，因而認(rèn)為它是冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、內(nèi)膜增厚的始動(dòng)因素。IL－1是由單核一巨噬細(xì)胞分泌的一種多肽，其免疫活性包括促進(jìn)細(xì)胞活化，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，參與炎癥反應(yīng)等。IL－1對細(xì)胞膜作用相似，它通過誘導(dǎo)單層重建和黏附蛋白的表達(dá)，破壞血凝一抗血凝平衡，形成血管內(nèi)凝血，使血流減慢、內(nèi)膜增厚。IL－1還誘導(dǎo)表達(dá)內(nèi)皮黏附分子、細(xì)胞間黏附分子等，可促進(jìn)白細(xì)胞黏附于表面。白細(xì)胞黏附、聚集使血管內(nèi)膜增厚，促進(jìn)AS的形成^[6]。IL－1β可明顯改變內(nèi)皮細(xì)胞的抗凝血功能；通過誘導(dǎo)前凝血過程，促進(jìn)血栓形成；增加內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，提高血小板活化因子(PAF)的水平。PAF是一種強(qiáng)大的血小板和白細(xì)胞的激活物以及血管收縮因子，血管收縮及血小板被激活都將觸發(fā)凝血系統(tǒng)，促進(jìn)血栓形成。IL一1β還促進(jìn)平滑肌細(xì)胞吸收低密度脂蛋白，使平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞^[7]。

ApoE是清除乳糜微粒和極低密度脂蛋白的受體的配體，缺乏ApoE則會導(dǎo)致血液循環(huán)中富含膽固醇的物質(zhì)積累而更加容易引起AS病灶形成。ApoE基因敲出小鼠無論正常或高脂飲食均可形成嚴(yán)重的高脂血癥及彌漫纖維增殖性AS損傷病灶^[1－3]。其所致的AS模型是緣于遺傳因素?fù)p傷，其病變更接近于人類AS，與進(jìn)食高脂飼料發(fā)生AS的動(dòng)物有根本區(qū)別，具有自然發(fā)生、漸進(jìn)發(fā)展、病理形態(tài)典型等特點(diǎn)，成為研究AS發(fā)病機(jī)理和干預(yù)措施較理想的動(dòng)物模型，也是篩選抗AS藥物及機(jī)理研究的良好實(shí)驗(yàn)平臺。

脂欣康膠囊由人參、銀杏葉、三七、綠茶提取物和牛磺酸組成，功能益氣養(yǎng)心健脾，活血通絡(luò)，化痰降濁，為補(bǔ)通結(jié)合，標(biāo)本兼顧之劑。現(xiàn)代藥理研究表明有降脂、抗AS、抗心肌缺血、抗氧化和保護(hù)血管內(nèi)皮等作用，合理配伍，可發(fā)揮多途徑、多部位、多靶點(diǎn)的綜合效應(yīng)。臨床研究表明^[4]，脂欣康膠囊具有降脂、降低AS指數(shù)、抗心肌缺血、保護(hù)血管內(nèi)皮、抑制血小板活化、抗脂質(zhì)過氧化等作用。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，脂欣康膠囊有對抗ApoE基因敲除小鼠AS斑塊形成和穩(wěn)定斑塊的作用^[3，8]，對該小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)有良好的修復(fù)和保護(hù)作用，但有關(guān)機(jī)理尚待闡明。本實(shí)驗(yàn)顯示，ApoE基因敲除小鼠血清TNF－α與IL－lβ顯著高于相同遺傳背景的正常C57BL／6J小鼠，脂欣康膠囊具有顯著抑制ApoE基因敲除小鼠血清TNF－α和IL－1β增高的作用，為闡明脂欣康抗AS、防治冠心病不穩(wěn)定型心絞痛的機(jī)制提供了部分科學(xué)依據(jù)。

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作者簡介：姜浩(1969—)，男，畢業(yè)于廣西中醫(yī)學(xué)院，現(xiàn)為于山東中醫(yī)藥大學(xué)2005級博士研究生(郵編：250014)；張文高、鄭廣娟、朱瑩，現(xiàn)工作于山東中醫(yī)藥大學(xué)。

(本文編輯 郭懷印)

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文”