疏血通注射液對(duì)急性腦缺血抗凋亡作用實(shí)驗(yàn)研究

【摘要】 目的 探討疏血通注射液對(duì)鼠腦缺血損傷的保護(hù)作用。方法 采用自體血栓注入、閉塞大腦中動(dòng)脈的方法制備MCAO模型，對(duì)照觀察假手術(shù)組、MCAO模型組、疏血通治療組腦梗死范圍、腦含水量、神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織病理變化、腦缺血邊緣區(qū)神經(jīng)元凋亡和凋亡相關(guān)基因bcl2、bax蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果 疏血通治療組與其他兩個(gè)對(duì)照組相比，能顯著改善神經(jīng)功能缺失癥狀，減小梗死體積和腦水腫含量、腦組織顯微結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)改變均較輕，缺血邊緣區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)量減少，bcl2表達(dá)增多，bax表達(dá)明顯減少(P均<0.05或<0.01)。結(jié)論 疏血通注射液對(duì)缺血性腦損傷有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】 疏血通注射液；腦缺血；保護(hù)作用；鼠

文章編號(hào)：1003-1383(2007)03-0242-03

中圖分類號(hào)：R 364.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

疏血通注射液是動(dòng)物類中藥復(fù)方制劑，由水蛭、地龍合理組方經(jīng)低溫提取、膜分離等先進(jìn)工藝精制而成，主要用于心、腦缺血性疾病的防治。本文通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討疏血通注射液對(duì)急性腦缺血的抗凋亡作用機(jī)制，為臨床治療提供理論依據(jù)。材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料

(1)動(dòng)物：SD大鼠，體重230－300 g，雌雄不拘，由濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

(2)藥物和試劑：疏血通注射液由牡丹江友博制藥有限公司提供(國藥準(zhǔn)字Z0010100號(hào))；紅四氮唑（TTC）由上海生物工程公司提供；凋亡試劑盒購自美國ROSS公司；兔抗Bcl2多克隆抗體、兔抗Bax多克隆抗體、SP9001均購自美國Santa cruz公司，由北京中山生物技術(shù)公司分裝。

(3)儀器：TD2000圖像分析系統(tǒng)（北京天地公司）；24號(hào)靜脈留置針（型號(hào)REF 383213，規(guī)格0.7×19 mm），4號(hào)硬脊膜外麻醉導(dǎo)管(型號(hào)F3×70，0.7－1.0×700)，分析天平（日本島津）。

2.方法

(1)分組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分假手術(shù)組、局灶腦缺血對(duì)照組、局灶腦缺血疏血通治療組，每組30只大鼠。

(2)局灶腦缺血模型制作：采用自體血栓大腦中動(dòng)脈閉塞模型：用3.5%水合氯醛1 ml/kg腹腔麻醉大鼠后，取左側(cè)頸部直切口， 分離左頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，電凝頸外動(dòng)脈分支：甲狀腺上動(dòng)脈，枕動(dòng)脈，結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈重要分支翼腭動(dòng)脈。離斷頸外動(dòng)脈（假手術(shù)組到此步為止）， 從頸外動(dòng)脈插入24號(hào)靜脈留置針，將針芯拔出，取血0.5－1.0 ml，4000 r/min離心２分鐘，按５∶1吸取血漿及少量紅細(xì)胞10 μl，加入凝血酶3－4 μ，制成直徑 為0.35 mm的血栓，切成1.5 mm大小，用麻醉導(dǎo)管吸取6－8個(gè)血栓，接到靜脈留置針末端，快速將栓子推入頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)內(nèi)。動(dòng)物蘇醒后按Bederson 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)立即進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分，有體征者入選。

(3)給藥方法：治療組按0.25 ml/kg疏血通注射液濃縮液，局灶腦缺血對(duì)照組予以等量生理鹽水，均于造模后6小時(shí)內(nèi)經(jīng)尾靜脈注入，以后每天一次連續(xù)5天。

(4)神經(jīng)功能缺損評(píng)分：進(jìn)行兩次神經(jīng)功能缺損評(píng)分，于造模成功后第一天進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，治療、觀察5天后再進(jìn)行一次。按Bederson 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［1］評(píng)分，0級(jí)（0分）：無神經(jīng)功能障礙；1級(jí)(1分)：提大鼠尾，見癱瘓側(cè)前肢回收屈曲不能正常伸向地面；2級(jí)(2分)：除1級(jí)體征外，向癱瘓側(cè)推時(shí)感阻力較對(duì)側(cè)明顯降低；3級(jí)（3分）：除以上體征外，大鼠爬行時(shí)向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)。

(5)腦梗死體積測(cè)定：每組取10只大鼠于造模5天神經(jīng)功能缺損評(píng)分后取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，剩下的部分立即冠狀切成5片，置于2%的TTC溶液中染色，梗死區(qū)為蒼白色，正常為玫瑰紫紅色［2］。用TD2000圖像分析系統(tǒng)測(cè)出各層的梗死面積，總面積之和乘以層厚即為體積（mm3）［3］。

(6)腦含水量的測(cè)定：每組取10只大鼠用干濕重法測(cè)腦組織含水率，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，將大鼠斷頭取腦立即切成左右兩半，迅速用電子天平稱取病灶側(cè)半球的重量，然后置于100℃烤箱內(nèi)烤24小時(shí)，用同一天平再次稱重，以［(濕重－干重)/濕重×100%］即為相對(duì)含水量［4］。

(7)組織病理學(xué)觀察：每組取7只大鼠，用４％的多聚甲醛灌流固定，切為５μm的石蠟切片，每個(gè)腦標(biāo)本隨機(jī)選其中兩張進(jìn)行常規(guī)HE染色觀察病灶區(qū)組織病理顯微結(jié)構(gòu)變化，其余的用于細(xì)胞凋亡原位末端（TUNEL）標(biāo)記、Bcl2及Bax蛋白兔疫組化染色觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因的表達(dá)。另外每組取3只大鼠用２.5％的戊二醛灌注固定后，取病灶周圍腦組織修成1 mm3的組織塊送電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)改變。

(8)凋亡細(xì)胞和Bcl2、Bax蛋白表達(dá)檢測(cè)：凋亡細(xì)胞檢測(cè)用末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法即TUNEL法，參照試劑盒說明進(jìn)行。Bcl2、Bax蛋白表達(dá)按常規(guī)ABC法染片，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。在40倍物鏡下觀察每張切片TUNEL陽性細(xì)胞、Bcl2、Bax免疫陽性細(xì)胞的表達(dá)情況，用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)TD2000處理，采集圖像輸入計(jì)算機(jī)，以灰度計(jì)算所選視野陽性染色的單位面積(陽性細(xì)胞的面積占所選整個(gè)視野面積的百分比)，每張切片取梗死灶邊緣區(qū)互不重疊的5個(gè)視野，其均值即為該標(biāo)本每個(gè)高倍鏡視野中陽性細(xì)胞的單位面積。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-±s）表示，應(yīng)用ssps10.0 forwindows統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

結(jié)果

1.疏血通對(duì)大鼠神經(jīng)行為、腦梗死體積和腦含水量的影響結(jié)果 第1天局灶腦缺血組和疏血通治療組（用藥前）神經(jīng)功能缺失評(píng)分并無顯著性差異。第5天經(jīng)過疏血通的治療，疏血通治療組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯降低，和局灶腦缺血組比較差異顯著(P<0.01)；且疏血通治療組梗死范圍以及腦組織含水量亦明顯低于局灶腦缺血組，有較顯著的差異(P<0.01)。表明疏血通對(duì)腦組織缺血有明顯治療作用。見表1。

2.組織病理學(xué)變化 光鏡下假手術(shù)組大鼠皮層各層細(xì)胞排列整齊，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)基質(zhì)無水腫，基底神經(jīng)節(jié)區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)纖維無損壞，局灶腦缺血組大鼠病理改變?yōu)樯窠?jīng)元結(jié)構(gòu)模糊，胞體腫脹，胞核淡染，核固縮，尼氏小體減少或消失等變化；疏血通治療組見大腦皮質(zhì)錐體細(xì)胞和腦實(shí)質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，核固縮、核溶解程度較局灶

作者簡介：吳蘇寧(1965-)，男，山東省濟(jì)寧市人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士。腦缺血對(duì)照組明顯減輕，病變范圍明顯縮小。電鏡下假手術(shù)組大鼠細(xì)胞膜完整，核仁清楚，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)形態(tài)正常。局灶腦缺模型組神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死，部分溶解。線粒體腫脹、變形。核染色質(zhì)邊集，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)紊亂。疏血通治療組神經(jīng)元胞體輕度腫脹，核膜完整，核染色質(zhì)分布均勻，神經(jīng)氈輕度腫脹，部分血管管周輕度水腫，較局灶腦缺模型對(duì)照組超微結(jié)構(gòu)改變明顯減輕。

3.凋亡細(xì)胞和Bcl2、Bax蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 光鏡下TUNEL染色陽性的凋亡細(xì)胞為圓形或橢圓形，細(xì)胞核或胞漿中有棕色顆粒，核染色質(zhì)濃聚呈邊聚觀象，似月牙形，有時(shí)可見細(xì)胞膜皺褶，以及芽生形成膜包裹的凋亡小體。陽性細(xì)胞呈簇狀或散在分布于梗死灶邊緣區(qū)域。假手術(shù)組腦組織TUNEL染色只有零星的細(xì)胞凋亡，而局灶腦缺血對(duì)照組凋亡細(xì)胞略有增多，疏血通治療組較缺血對(duì)照組凋亡細(xì)胞明顯減少(P<0.01)。光鏡下 Bcl2陽性細(xì)胞核膜和胞漿呈棕黃色。假手術(shù)組可見少量表達(dá)，局灶腦缺血對(duì)照組較假手術(shù)組增多(P<0.01)，多分布在缺血周圍區(qū)域，而病灶中心未見陽性細(xì)胞。疏血通治療組表達(dá)最多，與局灶腦缺血對(duì)照組及假手術(shù)組比較有顯著性差異(P<0.01)。光鏡下Bax陽性細(xì)胞胞漿、胞核均著色，呈均勻彌漫棕黃色染色，多分布于缺血周圍區(qū)域， 疏血通治療組Bax陽性細(xì)胞的表達(dá)明顯少于局灶腦缺血對(duì)照組(P<0.01)。見表2。

討論

急性缺血性腦血管病是一種常見病、多發(fā)病，死亡率及致殘率均很高。迄今為止，尚無普遍有效的治療措施。已有研究表明，腦血管閉塞后若缺血區(qū)血流未能在短期內(nèi)恢復(fù)供應(yīng)，處于嚴(yán)重缺血狀態(tài)的中心區(qū)會(huì)很快發(fā)生壞死即梗死，而梗死灶周圍的缺血邊緣區(qū)則出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，邊緣區(qū)中細(xì)胞凋亡的發(fā)生可能是梗死灶擴(kuò)大的關(guān)鍵［4］。如不能及時(shí)糾正或提早預(yù)防半暗區(qū)神經(jīng)元凋亡的發(fā)生，半暗區(qū)將不可避免成為永久性梗死灶的一部分。而阻斷缺血半暗區(qū)神經(jīng)元凋亡，對(duì)于減少梗死灶體積，改善中風(fēng)患者的預(yù)后具有重要意義

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：疏血通注射液能顯著減少缺血邊緣區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量、促進(jìn)抗凋亡的Bcl2蛋白的表達(dá)，抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而有效地抑制了神經(jīng)元的凋亡和進(jìn)一步的壞死，對(duì)缺血腦組織具有顯著的保護(hù)作用，同時(shí)結(jié)果也表明疏血通注射液組大鼠腦梗死范圍、腦水舯、神經(jīng)功能缺損均明顯低于對(duì)照組。

疏血通注射液主要成分是水蛭、地龍，其主要有效成分為水蛭中的水蛭素類和地龍中的蚓激酶樣作用物質(zhì)，其抗腦缺血的主要作用機(jī)制為一方面可通過其促纖溶、抗凝作用，溶解血栓使血管再通而恢復(fù)血液灌注，及時(shí)改善缺血半暗區(qū)血液循環(huán)，阻止病變進(jìn)一步惡化、進(jìn)展。另一方面可通過其神經(jīng)保護(hù)作用如抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及壞死等作用機(jī)制，減輕缺血半暗區(qū)腦組織損傷。本研究結(jié)果闡明疏血通注射液具有減輕腦組織水腫，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及壞死等腦缺血保護(hù)作用，為臨床腦血管病的防治提供理論依據(jù)。

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