高效液相色譜法在食品安全檢測中的應用概況

【關鍵詞】 高效液相色譜法；食品安全檢測

文章編號：1003-1383(2007)03-0323-03

中圖分類號：R 994.4文獻標識碼：B

食品貿易的全球化使廣大消費者受益，大量高品質、價格合理、安全的食品應運而生，滿足著廣大消費者的需要。日趨加速的城市化狀況導致食品的制作、運輸、貯存、銷售需求不斷增加。同時還會有一些不法制假商販制造或販賣偽劣食品，甚至在食品中摻入有毒化學品，給消費者造成極大傷害，這就需要有一套完整的監測監督機制。作為降低食源性危害的有效手段，許多食品安全項目正越來越側重于從農田到餐桌的整個過程，雖然國家在保證食品安全方面作大量的工作，每年仍有相當數量的消費者因進食受污染的食品而中毒、發病、乃至死亡。當今農產品、食品安全已成為世人十分關注的熱門話題，食品安全監測面臨著嚴峻挑戰，因此，急需建立快速調查食源性疾病和監測食品污染的措施和方法。本文就高效液相色譜(HPLC)技術在食品安全檢測方法中的應用概況作一綜述。

食品不安全因素及HPLC應用范圍

據報道，每年世界上發生的食品污染病例在7000萬例以上。食源性疾病的爆發已引起媒體的廣泛關注和消費者的關心。當前食品中的不安全因素主要表現在以下幾個方面［2］：微生物、寄生蟲等生物污染；環境污染；農用、獸用化學物質的殘留；自然界存在的天然毒素；營養素不平衡；食品加工和貯藏過程中產生的毒素；食品添加劑的使用；食品摻偽；新開發的食品資源及新工藝產品；包裝材料。食品中最常見的有毒有害物質是有機合成農藥、獸藥殘留物及污染物和致病菌。

高效液相色譜法(HPLC)是上世紀60年代末70年代初發展起來的一種新型分析分離技術。它是由現代高壓技術與傳統的液相色譜方法相結合，加上高效柱填充物和高靈敏檢測器所發展起來的新型分離分析技術，是以經典液相色譜法為基礎，引入了氣相色譜的理論與實踐方法，流動相改為高壓輸送，采用高效固定相在線檢測手段發展而成的分離分析方法，分離機制是靠被分離組分的分子與流動相分子爭奪吸附表面活性中心的吸附能力差別而分離(可用吸附系數Ka衡量吸附能力的差異)，是現代分離分析的重要手段，隨其分離檢測技術的日益完善，已被廣泛應用于各個學科中。由于它只要求樣品能制成溶液，而不需要氣化，因此不受樣品揮發性的約束。對于揮發性低，熱穩定性差，分子量大的高分子化合物以及離子型化合物尤為有利，如氨基酸、蛋白質、生物堿、核酸、甾體、脂類、維生素、抗生素等分子量較大，沸點較高的合成藥物以及無機鹽類。所以說HPLC具有適用范圍廣、分離效率高、速度快、流動相可選擇范圍寬、靈敏度高、色譜柱可反復使用、流出組分容易收集、安全等優點。世界上約有80%的有機化合物可以用HPLC來分析測定［1］。

HPLC對食品添加劑及農藥的測定

蘇丹（Sudan）色素是一種人工合成染料，在化工生產中主要用于對油類、蠟和肥皂的染色。有關研究表明，蘇丹Ⅰ號（Sudan Ⅰ）會導致鼠類患癌，它對人類肝細胞也顯現出可能致癌的特性。李軍［3］等建立了食品中4種蘇丹色素的高效液相色譜同時測定方法。采用乙腈提取后經凝膠滲透色譜法對樣品進行凈化，利用反相高效液相色譜法，以乙腈－酸性水溶液為流動相，采用梯度洗脫，以二極管陣列檢測器定性定量測定食品中的4種蘇丹色素，結果最低檢出限分別為0.102、0.097、0.074、0.099 mg/kg。阿斯巴甜、糖精鈉、乙酰磺胺酸鉀等添加劑對人體有一定的毒害作用。特別是阿斯巴甜，它在體內代謝過程中的主要降解物為苯丙氨酸和天門冬氨酸，對于苯丙酮尿病(PKU)患者，因其代謝缺陷，體內過多的苯丙氨酸可影響患者的發育，所以有該病的患者要禁用添加阿斯巴甜的食品。劉思潔［4］等建立了一種可以同時測定飲料中糖精鈉、乙酰磺胺酸鉀、阿斯巴甜的方法，采用C18反向柱，以乙腈－0.02 mol/L硫酸銨溶液（5∶95）為流動相，在214 nm波長處檢測。結果以上三種甜味添加劑在飲料中最低檢出限為 4 μg/ml。目前蔬菜水果中不同種類農藥的殘留測定方法主要是氣相色譜法(GC)或氣相色譜 －質譜法 (GC－MS )，但GC對沸點高或熱穩定性差的農藥需進行衍生化處理，這樣就不可避免地增加了樣品前處理的難度，也使它的應用受到一定程度的限制。李永新［5］等建立了同時測定蔬菜水果12種農藥殘留的反相高效液相色譜分析方法。將樣品搗碎，用乙酸乙酯超聲提取，經Florisil固相萃取柱凈化、正己烷－二氯甲烷( 1∶1)洗脫、氮氣吹干、甲醇溶解并定容后，采用高效液相色譜柱分離、紫外檢測，以外標法定量。結果表明：5種有機磷農藥、6種擬除蟲菊酯類農藥和除草劑二甲戊樂靈的檢測限為0.114－2.65 ng。應用該法對從市場上隨機購買的蓮白、小白菜、黃瓜等20個蔬菜樣品和

作者簡介：陸興毅（1975-），男，廣西田陽縣人，主管藥師，理學士。蘋果、梨等20個水果樣品進行檢測，其中氧化樂果的檢出率分別為55%和45%，辛硫磷的檢出率分別為50%和30%，由此可見，國家明文規定的不得用于蔬菜、瓜果的劇毒、高毒農藥仍有檢出。

HPLC對食品中獸藥殘留物的測定

1.鹽酸克侖特羅(俗稱瘦肉精)系β2受體興奮劑，禁止作為畜禽類生長促進劑使用。近年來，我國曾多次報道了因食用含有鹽酸克侖特羅殘留的豬肉及內臟等造成的中毒事件。陳金枝［6］等建立HPLC法測定豬眼 、豬肝 、豬肺中微量鹽酸克侖特羅，樣品經乙醚－丁醇提取，用Hypersil C18色譜柱，甲醇－0.01 moL/L磷酸二氫鉀溶液為流動相。結果樣品中鹽酸克侖特羅最小檢測量為0.20 ng。用該法對市場上豬眼、豬肝、豬肺等30份樣品進行測定，結果在豬肺中的殘留在檢出限以下，豬眼、豬肝中最大殘留分別為0.96、0.22 mg/kg。

2.磺胺類藥物是抗感染藥劑，具有殺菌作用，因此在飼料中常常被添加。但是，過量的藥物殘留會損害人體健康。郭根和［7］等采用反相高效液相色譜法，用C18色譜柱、紫外檢測器，以5 mmol/L NaH2PO4溶液－乙腈溶液為流動相，測定蝦中磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧基嘧啶、磺胺喹惡啉等5種磺胺類藥物殘留，結果最低檢測限為2 μg/kg，符合痕量測定的要求。

3.薄海波［8］等采用柱切換直接進樣高效液相色譜法測定蜂蜜中3種四環素類抗生素(土霉素OTC、四環素TC、金霉素CTC)的殘留量，先用緩沖溶液溶解樣品后，直接進樣，以二次蒸餾水作流動相在C18預柱上在線富集和凈化，然后用柱切換閥將預柱與一個C18分析柱接通，以草酸溶液－乙腈－甲醇作流動相，紫外檢測器在350 nm處檢測。結果各組分回收率大于86%，相對標準偏差小于8.0％，最低檢出濃度為0.005 mg/kg，滿足了日本等國對進口蜂王漿中土霉素、四環素、金霉素殘留量（0.05 mg/kg)要求。

4.孔雀石綠、結晶紫屬三芳基甲烷化學物質，長期以來許多國家曾將其作為水產養殖業的殺菌劑，可用于魚類高發的水霉病、原蟲病的控制，但是進一步研究證實，孔雀石綠等進入人類或動物機體后，通過生物轉化可產生致癌、致畸、致突變等副作用，上世紀90年代以來許多國家都將其列為水產養殖的禁用藥物。任秀蓮［9］等研究水產品中孔雀石綠、結晶紫及其代謝物隱性孔雀石綠、隱性結晶紫的同時測定魚、蝦、蟹等可食部分上述化學物質的殘留量，樣品經離心提取后用PbO2－硅藻土柱為柱后氧化柱(35 mm×416 mm)，用乙腈－乙酸銨緩沖溶液－冰醋酸（58∶14∶28）為流動相，檢測波長618 nm，通過將ODS柱分離與 PbO2柱后衍生聯用，實現了4種物質的同時分離和測定。結果表明，石碟魚、螃蟹、蝦、刀魚樣品中孔雀石綠、隱性孔雀石綠、結晶紫、隱性結晶紫的殘留量均小于2 μg/kg。

5.激素是由內分泌腺和散在其它器官的內分泌細胞所分泌的微量生物活性物質，動物和人體內正常時含量甚微，殘留于動物性食品中的激素常為性激素，當性激素超過人體正常水平時，會破壞機體的正常生理平衡而呈現不良后果。因此對食品中激素殘留的測定十分重要。王帆［10］等研究檢測大豆異黃酮類保健食品中三種雌激素(雌二醇、雌酮、己烯雌酚)含量的分析法。采用Hypersil ODS2 Cl8色譜柱，流動相為甲醇－水(體積比53∶47)，流速 1.0 ml/min，檢測波長280 nm，該方法的線性范圍在 0.5－250 mg/L，三種雌激素的最低檢出限分別為0.8、0.9、0.4 mg/L。

HPLC對食品加工貯藏過程產生毒素的分析

一些食品在加工過程中會產生化學變化，生成對人體有害的物質。2002年4月瑞典斯德哥爾摩大學Margareta Tornqvist教授，首次在油炸及焙烤的馬鈴薯和谷物類食品中發現了具有神經毒性的潛在致癌物——丙烯酰胺(Acrylamide)，該毒物很容易經消化道、皮膚、肌肉或其他途徑吸收，并能通過胎盤屏障，是一種公認的神經毒素和準致癌物，已被WHO國際癌癥研究中心(IRAC)列為可能致癌物質(ⅡA 類)。2005年4月13日我國衛生部發布了“建議全國消費者避免食用油炸薯片和油炸薯條”的公告，呼吁采取措施減少食品中丙烯酰胺可能導致對健康的危害。柳其芳［11］等檢測食品中致癌物丙烯酰胺的固相萃取－二極管陣列檢測－反相高效液相色譜測定，用水提取食品中丙烯酰胺，采用C18固相萃取小柱對樣品液進行純化，流動相為甲醇－水(體積比5∶95)，DAD掃描波長范圍190－370 nm，檢測波長210 nm。結果丙烯酰胺在0.1－10 mg/L 濃度范圍內線性良好，方法檢出限為10 ng/g。用建立的方法分析了59份面包、谷類、豆類、堅果類和土豆類食品，結果顯示，食品炸焦的程度越深，則丙烯酰胺含量越高。食品貯藏不當，會引起真菌生長，造成食品的腐敗變質，同時有些霉菌產生的霉菌毒素，具有較強的毒性和耐熱性。黃曲霉毒素(AFT)是一種毒性極強的真菌毒素，目前已分離鑒定的有近20種，是一類化學結構相似的物質，其中以 B1、B2、G1、G2 和M1、M2為主。在天然污染的食品中以B1最為多見，其毒性和致癌性也最強。林裕［12］建立HPLC測定食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量的方法，采用ALLSPHERE ODS （250×416 mm）色譜柱，流動相為乙腈/水（梯度洗脫），熒光檢測器：激發波長360 nm，發射波長440 nm。結果最低檢出的B1、B2、G1、G2分別為濃度0.20 μg/kg，0.05 μg/kg，0.20 μg/kg，0.05 μg/kg。樣品進行凈化、衍生處理后，用熒光檢測器檢測，檢出的濃度比國標法［13］提高10倍。單端孢霉烯族化合物是鐮刀菌屬的霉菌和其它一些真菌產生的二次代謝產物，是引起人畜各種損害的天然有毒化合物，包括T－2毒素、HT－2毒素、NEO以及二乙酰鑣草鐮刀菌烯醇(DAS)四種毒素，具有著很強的致癌性，這類毒素紫外吸收強度極弱，用高效液相色譜分離－紫外檢測器檢測此類毒素，檢測的靈敏度低，選擇性差，許燁［14］等建立了高效液相色譜熒光檢測器測定谷物中A－型單端孢霉烯族化合物的方法。樣品經乙腈－水(84∶16)混合溶劑和二氯甲烷提取，通過FlorisilSep－Pak凈化柱凈化，以氧雜萘鄰酮－3－羰酰氯為衍生化試劑、4－二甲基氨基吡啶(DMAP)為催化劑進行衍生，然后再通過液液萃取凈化，以ZORBA XEclipse XDB－C18柱為分離柱，乙腈－水－0.75%醋酸(65∶35)為流動相，激發波長292 nm，發射波長425 nm進行高效液相色譜分離和檢測。結果四種毒素的濃度在0.01－2.0 μg/ml范圍內呈良好線性，檢出限為0.01 μg/g。

高效液相色譜法在食品安全性檢測和分析方面的應用范圍很廣，具有分離效率高、速度快、流動相可選擇范圍寬、靈敏度高、流出組分容易收集的優點，既可用于分離也可用于定量，更適用于各種各樣的化合物。而且隨著一些樣品前處理新技術，如固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)、基質固相分散萃取(MSPDE)、超臨界流體萃取(SFE)、凝膠滲析萃取(GPC) 技術相繼出現并很快推廣，以及計算機軟件開發、專家系統應用、檢測手段的進步及與質譜等儀器的聯用等相關問題的解決，高效液相色譜法的應用也會越來越多，在食品安全檢測中具有廣泛的應用前景。

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