環氧化酶－２在腎缺血再灌注損傷的實驗研究

【摘要】 目的 檢測大鼠腎缺血再灌注（I/R）損傷90分鐘后COX－2的表達，探討兩者的關系。方法 構建I/R模型，取30只大鼠平均分為6組，分別于再灌注后0、1.5、3、5、12和24 h處死，采用免疫組化染色分析分為0－4等級，計算COX－2的表達。結果 COX－2內皮細胞的表達在再灌注后3－5 h最明顯，12－24 h后逐漸減弱。COX－2的表達在再灌注后1.5、3、5、12和24 h均明顯高于0 h(P<0.05)。COX－2表達的最高峰后幾小時可發現腎（I/R）損傷最明顯。結論 COX－2表達和腎（I/R）損傷有關。

【關鍵詞】 缺血再灌注損傷；腎；環氧化酶

文章編號：1003-1383(2007)03-0248-02

中圖分類號：R 692 文獻標識碼：A

腎移植是終末期腎病患者可接受的治療方法。在腎移植中，腎缺血再灌注(I/R)損傷是臨床常見的問題。I/R損傷過程中炎癥反應被激活，導致細胞因子的形成，如腫瘤壞死因子、白細胞介素－1和花生四稀酸代謝產物等?；ㄉ南∷嵩诖x中產生一系列的炎癥產物，其中脂氧化酶和環氧化酶（COX－1和COX－2）參與其途徑。本文主要研究COX－2和大鼠腎I/R損傷的關系。材料和方法

1.缺血再灌注損傷模型 30只雄性Lewis大鼠（200－250 g）平均分為6組，用戊巴比妥鈉麻醉后剖腹。切除右腎，用止血鉗鉗夾左腎靜脈和動脈90分鐘后松開止血鉗。然后關腹。分別于0、1.5、3、5、12和24 h后處死大鼠，收集腎臟。缺血和非缺血的腎組織用10%福爾馬林溶液固定24 h，行HE和免疫組化染色。

2.免疫組化染色 免疫組化染色按照美國Cayman chemical公司提供的抗生素蛋白－生物素過氧化物酶試劑盒進行操作。在顯微鏡下行腎組織切片并脫石蠟。切片浸潤在含有0.3%過氧化物的甲醇溶液45分鐘，以除去內在的過氧化物酶活性。非特異連接帶浸泡在0.2%小牛血清蛋白和羊血清中20分鐘（用磷酸鹽緩沖液［PBS］按1∶66.7稀釋）。用抗兔COX－2的抗體或正常兔血清按1∶100稀釋，滴入組織切片，在室溫潮濕室內孵育30分鐘。然后用PBS沖洗切片10分鐘，將生物酰基化的羊抗兔IgG加入組織切片，在室溫下孵育30分鐘，再用PBS沖洗10分鐘，切片用生物?；锼氐鞍走^氧化物酶孵化45分鐘。最后，切片在過氧化物底物溶液浸潤2－7分鐘顯色。

3.COX－2表達計數分析 根據每個樣本抗COX－2抗體染色的范圍、程度和陽性細胞數將染色分為5個等級（0－4+），評估所有組織并記分。A4+表示標本染色最濃，而0表示染色缺失。同時也記錄顯微解剖學下染色的位置，結果取平均值。

4.統計學分析 采用SPSS（10.0版）統計軟件包處理，所有實驗數據采用-±s，組間參數比較采用t檢驗。

作者簡介：農紹軍(1972-)，男，廣西天等縣人，主治醫師，在讀博士。

結果

1.COX－2 HE染色和免疫組化染色 環氧化酶－2只在正常腎內皮細胞有表達，再灌注后3－5 h COX－2表達明顯增強，再灌注5 h后腎小管上皮細胞出現輕微的損傷，再灌注12 h后壞死蔓延到整個缺血的腎，幾乎所有的腎小管上皮細胞都損傷，但再灌注12－24 h后，COX－2在內皮細胞的表達逐漸減弱(圖1)。

2.COX－2的表達計數 COX－2的表達計數見表1，其中發生缺血前的表達數是0.7±0.3，再灌注后1.5、3、5、12和24 h均明顯高于0 h(P<0.05)。見表1。

討論

在腎移植中，I/R損傷可影響腎功能，缺血時間短，則腎損傷較輕。近來，觀察宮內缺血缺氧再灌注后，胎鼠腎組織COX－2蛋白表達上調，PGI2及PGE2含量隨灌注時間的延長而上升，說明宮內缺血缺氧再灌注可選擇性誘導胎腎COX－2蛋白表達增強，通過PGI2及PGE2對其起保護作用［1］。國外對I/R損傷的研究集中在于中性粒細胞的功能、炎癥細胞因子的作用、組織因子和氧自由基的激發等所帶來的血管阻塞、水腫和其它并發癥等［2］。

COX－1和COX－2在磷脂酶A2作用下從細胞膜的磷脂轉導到花生四烯酸，通過PGI2將花生四烯酸轉變成PGH2。COX－1存在于血小板、胃和腎臟等組織中，在血小板參與TXA2生成、在血管內皮細胞和胃黏膜細胞參與PGI2生成、在腎臟參與PGE2生成。它還參與生理功能的調節，如維持血小板的凝聚、胃液的分泌、利尿、血壓和血流。但COX－2在正常情況下很少有表達，但在癌基因啟動子、內毒素和激素刺激下由于細胞因子（白細胞介素－1）作用，在巨噬細胞、纖維和滑膜細胞中可上調其表達。COX－2和炎癥、發熱、癌癥、血管形成、過敏性休克、骨代謝和凋亡有關。COX－1和COX－2的主要區別是后者是細胞因子、生長因子和癌基因誘導的酶，只有COX－2能利用通過磷脂酶A2在細胞中釋放的花生四烯酸。

本文主要探討腎I/R損傷模型下COX－2的表達。I/R損傷后在3－5 h時，COX－2的表達最明顯，I/R損傷后12－24 h觀察到組織損傷最明顯，提示COX－2和腎I/R損傷之間有明顯關聯，和國外的Matsuyama等報道相似［3］。可能與COX－2通磷脂酶A2作用，在細胞中釋放花生四烯酸，參與PGI2和PGE2的合成，從而起到對腎的保護作用。但是，文獻報道COX－1mRNA不受I/R的影響［4，5］。本研究只是對COX－2和腎I/R損傷的關系做了初步的研究，關于COX－2在腎I/R損傷的機制，有待進一步的探討。

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