馬齒莧總黃酮對大鼠血管平滑肌細胞增殖的影響

【摘要】 目的 觀察馬齒莧總黃酮對大鼠主動脈平滑肌細胞(RASMC)增殖的抑制作用及機制。方法 由細胞計數、MTT法測定細胞增殖率，采用羥胺法、TBA方法分別測定培養液中SOD活性、MDA含量。結果 馬齒莧總黃酮（16.0、32.0、64.0 μg/ml）以濃度依賴方式抑制RASMC增殖及抑制氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）誘導RASMC增殖，可誘導少量RASMC凋亡，馬齒莧總黃酮預處理24 h后已出現明顯的抗增殖作用，提高培養液中SOD活性、降低MDA含量。結論 馬齒莧總黃酮具有抗RASMC增殖作用，該作用與提高SOD活性、降低MDA含量有關。

【關鍵詞】 馬齒莧總黃酮；主動脈平滑肌細胞；細胞增殖；氧化型低密度脂蛋白；SOD；MDA

文章編號：1003-1383(2007)03-0237-03

中圖分類號：R 285.5 文獻標識碼：A

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一類嚴重威脅人類健康的常見病、多發病，是心腦血管疾病的重要病理基礎，由AS誘發的心腦血管疾病是導致世界人口死亡的主要原因。近年來，心腦血管疾病的發病率、死亡率在我國一直呈明顯上升的趨勢。病理狀態下，血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle clls，VSMC）由收縮型轉變為合成型后，遷移至內膜，大量增殖和分泌細胞外基質，由此導致血管增生重構，這是許多心血管疾病的重要病理變化［1］。研究VSMC的異常增殖機制，通過不同方式阻斷其增殖途徑是治療心血管疾病的策略之一，抑制VSMC增殖是目前有效防治AS、高血壓、血管再狹窄和延緩衰老的新途徑。馬齒莧是我國常用的傳統中藥，也是人們常作蔬菜食用的野菜。現代藥理學研究證實，馬齒莧具有抗氧化、抗血栓、降血脂［2］、增加膜脂流動性［3］，整體動物實驗顯示有抗AS作用［4］。馬齒莧總黃酮對VSMC增殖作用的影響及其作用機制的影響，在國內外報道很少，因此，本文報道研究馬齒莧總黃酮抗VSMC增殖作用及其機制，為尋找開發滿意的抗VSMC增殖藥物，為馬齒莧用于防治AS、高血壓、血管成形術后再狹窄等主要心血管疾病和延緩衰老提供科學理論依據。

材料與方法

1.藥品和儀器 馬齒莧總黃酮（PTF）由本實驗室按文獻方法［5］制備，實驗前用DMEM調滲透壓、pH值，儲存在-20℃冰箱中備用，加藥時在培養基中稀釋到所需濃度，使二甲基亞砜（DMSO）占培養基中的終濃度不超過1%。丙二醛（malonyldiadehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（supuroxide

※基金項目：湖南省教育廳資助項目(項目編號：05C628)

作者簡介：盧新華（1957-），男，湖南省郴州市人，高級實驗師。 dismutase，SOD）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。胎牛血清（FBS）為杭州四季清生物材料有限公司產品，DMEM培養基為美國Gibco公司產品。MTT和DMSO為美國sigma公司產品。HH.CPTW水套式二氧化碳培養箱（上海?，攲嶒瀮x器有限公司），1×70熒光倒置相差顯微鏡（olympus公司，日本），C×7 Delta 生化儀（Beckmom，美國）。

2.實驗動物 雄性SpraqueDawley大鼠一只，8-10 W，100-150 g，由中南大學實驗動物科學部提供。

3.大鼠主動脈的平滑肌細胞(RASMC)的原代培養、傳代培養與鑒定［6］ 采用組織塊種植法進行RASMC原代培養，無菌條件下取出大鼠胸動脈Hanks液洗滌，剪成25 mm×30 mm的血管段，放入10%FBS DMEM培養液(含1×105u·L-1青霉素，100 mg·L-1鏈霉素，25 mmol·L-1HEPES)，剝離外膜，將動脈縱行剪開，刮去內膜，剪成1 mm3左右的組織塊，移入培養瓶，于37℃孵箱靜置培養。每三天更換一次培養液，待細胞生長融合出現“峰與谷”結構時，用0.05%胰蛋白酶(含0.02%EDTANa)消化，首次傳代按1∶1，以后每隔3～5天按1∶3傳代，經形態學和免疫組化鑒定為平滑肌細胞，實驗用第5～10代細胞。

4.氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)分離提取［7］ LDL(α=1019～1060 g/ml)用序列超速離心方法分離正常人血漿獲得，在0.005M Nacl，0.02%EDTA，pH7.4鹽溶液中充氮透析48 h，4℃保存備用，在使用前透析48 h去除EDTA獲得LDL。LDL在含10 μmmol/L，pH7.4 PBS中透析5 h，獲得oxLDL，與非氧化LDL電泳速度為15∶1。

5.PTF對RVSMC增殖的影響

(1)RVSMC計數：取生長穩定80%～90%融合的VSMC，消化后以相同密度接種于24孔培養板，1×106/孔，1 ml/孔37℃培養24 h，更換含0.5%FBS的DMEM培養液培養48 h，細胞同步化。實驗分組:空白對照組(含0.5%DMSO)， PTF組：2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μg/ml。每組6個復孔，各組均用10%FBS DMEM培養液配制，加藥后孵育72 h，終止反應，胎盼藍(trypam blue)染色，活細胞計數，實驗重復3次。

(2)MTT法：取傳代培養5～10代RASMC 1×106/孔接種于96孔培養瓶中培養，實驗分組劑量同(1)，每組6孔。培養24 h后每孔分別加入不同劑量的PTF，培養48 h后加入MTT液(20 μl/孔)，繼續培養4 h，吸出孔內培養基后，加入DMSO，終止反應，室溫下振蕩10 min，使結晶溶解，置酶標儀在吸收波長570 mm條件下測定吸光度值。

(3)PTF對oxLDL促平滑肌細胞增殖作用的影響：取傳代培養5～10代的RASMC（1×106/孔）接種于96孔培養瓶中，培養24 h后每孔分別加入不同劑量的PTF (64.0、32.0、16.0、8.0 μg/ml)，每組6孔，每孔均加入oxLDL(10 μgLDL蛋白/ml)3 ml，空白對照組的細胞培養液中不加馬齒莧總黃酮及oxLDL，oxLDL組的細胞培養液中加入相同劑量的oxLDL，培養48 h后用MTT法測定細胞數量。

6.PTF對RASMC計數時效關系的影響 取生長穩定80%～90%融合的RASMC，消化后以相同密度接種于24孔培養板，3×106/孔，1 ml/孔，37℃培養24 h。更換含0.5%FBS的DMEM培養液，培養48 h，細胞同步化，實驗分組：①對照組（10%FBS DMEM 培養液配制），②PTF組（PTF 32.0 μg/ml， DMEM配制），③oxLDL組（10 mgLDL蛋白/ml，DMEM配制），④PTF＋oxLDL組（同②、③），每組6個復孔，分別于孵育24 h，48 h，72 h終止反應，胎盼藍染色，活細胞計數，實驗重復3次。

7.PTF對RASMC凋亡的影響 取傳代培養5～10代的RASMC（2×106/ml）接種于100 ml培養瓶中，48 h后給藥。分4個組，第1～3組為PTF誘導細胞凋亡組（培養液中PTF濃度分別為128.0 μg/ml、64.0 μg/ml、32.0 μg/ml）， 第4組為空白對照組，每組3瓶。給藥28 h后收獲細胞，用Y啶橙結合臺胎藍染色觀察細胞凋亡情況。

8.培養液中SOD、MDA含量測定 選用生長良好的第4～5代RASMC，調整細胞密度為2×105/ml，接種在小培養皿內的蓋玻片上，每片0.1 ml，讓其貼壁后從培養皿周邊加培養液至15 ml，置培養箱中培養，待細胞生長成片狀時，分為兩組給以不同條件培養，對照組不加藥， PTF組（終濃度為每ml培養液中含PTF 48.0 μg），培養24 h后收集培養液，離心10 min（1000 r/min）。取上清液作為待測樣品， 測定超氧化物歧化酶（SOD）活性和脂質過氧化物的穩定產物丙二醛（MDA）含量，按試劑盒方法測定。

9.統計學處理 所有實驗數據均采用-±s表示，組間差異比較采用t檢驗。

結果

1.PTF對RVSMC增殖的影響 PTF 2.0、4.0、8.0 μg/ml劑量組與空白對照組比較無統計學意義(P>0.05)；劑量增加到 16.0、32.0、64.0 μg/ml時，抑制RASMC增殖作用與空白對照組比較有顯著性差異（P<0.05或P<0.01），且存在明顯的劑量效應關系。見表1。

2.PTF對oxLDL促RASMC增殖作用的影響 PTF 64.0、32.0、16.0 μg/ml劑量組對oxLDL促RASMC增殖具有顯著的抑制作用，此抑制作用與oxLDL組比較有顯著差異（P<0.05或P<0.01），能濃度依賴性地降低其數量；oxLDL具有顯著的促RASMC增殖作用，與空白對照組比較有顯著性差異（P<0.01）。見表2。

3.PTF對RASMC計數時效關系的影響 從PTF抑制oxLDL促RASMC增殖的時效關系顯示，PTF預處理24～72 h，RASMC增殖數量比oxLDL組低，分別是oxLDL組的47.5%、32.6%、24.2%，能時間依賴性地抑制其生長。從RASMC計數時效關系顯示，PTF預處理24～72 h，RASMC增殖數量比對照組低，分別是對照組的42.4%、35.3%、28.7%，能時間依賴性地抑制其生長，結果提示PTF孵育24 h已出現明顯的抗增殖作用。

4.PTF對RASMC凋亡的影響 PTF 128.0 μg/ml、64.0 μg/ml、32.0 μg/ml劑量組的RASMC胎盼藍著色百分率分別為(54.0±6.72)%，(10.45±2.43)%，(6.12±1.30)%，空白對照組的RASMC胎盼藍著色百分率為(4.74±1.84)%；PTF 128.0 μg/ml、64.0 μg/ml、32.0 μg/ml劑量組的RASMC凋亡率分別為6.5%，4.7%，5.1%，空白對照組的RASMC凋亡率為0.8%；PTF組與空白對照組比較有顯著差異（P<0.05）；PTF 64.0 μg/ml時，形態學觀察未見明顯的細胞形態變化。

5.PTF對培養液中SOD、MDA含量的影響 PTF預處理24 h后培養液中SOD含量明顯高于空白對照組，MDA含量明顯低于空白對照組，PTF組與空白對照組比較具有顯著性差異（P<0.05）。見表3。

討論

動脈粥樣硬化（AS）是嚴重威脅人類健康的疾病之一，其發生機制十分復雜，在導致動脈粥樣硬化的諸多危險因素中，一般認為高血脂癥通過損傷血管內皮細胞，促進SMC異常增殖等作用而成為導致AS的重要致病因素，在AS的發生與發展中，VSMC的增殖、遷移及表型轉變起著十分重要的作用，因而研究尋找抗VSMC增殖，特別是能夠抑制oxLDL刺激的VSMC異常增殖的藥物將具有重要意義。

研究發現氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）可促使血管平滑肌細胞由收縮轉變為合成型，并有促使平滑肌細胞遷移和游走作用，可誘發一系列與細胞增殖有關的反應如SIS、JUN和RAS的表達增加，還可促使血管壁細胞合成內皮素、血小板源生長因子，激活蛋白激酶C，促使VSMC增殖［8］。本文實驗結果顯示oxLDL具有促使大鼠血管平滑肌細胞增殖作用，PTF能明顯抑制oxLDL促大鼠血管平滑肌細胞增殖作用，同時也具有直接抑制大鼠血管平滑肌細胞增殖作用，在一定劑量范圍內呈現明顯的劑量依賴性，能誘導少量大鼠血管平滑肌細胞凋亡。

近年研究發現，氧自由基能明顯增強血管平滑肌細胞的SIS基因表達，促使大鼠血管平滑肌細胞增殖，活化的血管平滑肌細胞還可釋放氧自由基，氧自由基易作用于膜脂質引起脂質過氧化，產生大量脂質過氧化物(LPO)，LPO能刺激中膜平滑肌細胞轉入內膜增生。本文實驗結果顯示，PTF組培養液中SOD含量明顯提高，MDA含量明顯降低。結果提示，馬齒莧總黃酮有抗RASMC增殖作用，該作用與提高SOD活性、降低MDA含量有關。但有關馬齒莧總黃酮抗VSMC增殖作用及其機制的研究有待進一步探討。

致謝：本實驗研究承蒙中南大學湘雅醫學院陳鋼等老師的大力支持，在此致以衷心的感謝。

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