人幽門螺桿菌熱休克蛋白Ａ編碼基因的克隆及表達

【摘要】 目的 擴增人幽門螺桿菌（Hp）熱休克蛋白A(HspA)編碼基因并構建其重組表達載體，進行核苷酸序列分析，并在E.coli BL21中表達，為疫苗的開發(fā)奠定了基礎。

方法 利用PCR技術從Hp基因組DNA中擴增熱休克蛋白A（HspA）基因片段，目的基因經SacⅠ和XhoⅠ雙酶切、純化后，插入pET32a(+)載體。以含目的基因片段的重組載體轉化大腸桿菌BL21并表達。結果 經PCR、酶切、測序分析表明，插入的基因片段為Hp HspA編碼基因，與GenBank報道的相比較，核酸同源性達98%。經SDS-PAGE分析，表達的融合蛋白分子量約為33 KD，其中目的蛋白的分子量約為13 KD。結論 成功地克隆并表達了Hp HspA編碼基因，為HspA蛋白質疫苗的研制和快速診斷試劑盒的開發(fā)奠定了良好的基礎。

【關鍵詞】 幽門螺桿菌；熱休克蛋白A；重組載體；基因表達

文章編號：1003-1383(2007)06-0666-03中圖分類號：R 392-33文獻標識碼：A

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是上消化道疾病的主要致病菌，在人群中的感染率極高，我國普通人群的感染率為50%～80%，每年新增感染人數近千萬［1］。Hp不僅是導致慢性胃炎、消化性潰瘍及胃癌、胃黏膜相關性淋巴組織(MALT)淋巴瘤等胃部疾病的主要致病細菌，而且與腸道外疾病的發(fā)生也有顯著的作用，故已被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構列入第一類致癌原［2~4］。根據Hp的感染，臨床上多采用復合抗生素療法，雖然可以達到一定的效果，但卻存在再次感染、誘導耐藥菌株流行、藥物副作用和費用較高等問題，且不能達到預防Hp感染的目的。因此，發(fā)展Hp疫苗是預防Hp感染最有效、最有前景的方法。Hp的致病性包括它的動力、黏附力、尿素酶、磷脂酶A、熱休克蛋白和毒素等，其中HspA為所有的Hp共同的抗原成分，可刺激機體產生保護性免疫反應。本研究采用基因克隆技術，構建了含HspA基因的重組質粒，并在E.coli中進行表達，為Hp疫苗的研制奠定了基礎。

材料和方法

1.材料 ①菌株和質粒：標準Hp菌株11637由本校微生物學教研室提供；DH5α、BL21菌株和pET32a(+)載體為本實驗室保存。②主要試劑：PrimeSTAR聚合酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶（SacⅠ和XhoⅠ）、DNA Marker均為TaKaRa公司產品。細菌基因組DNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒及膠回收試劑盒均為上海華舜生物工程有限公司產品。③引物設計：通過GenBank查詢，應用Primer 5.0設計 Hp HspA編碼基因的引物P1和P2，P1的序列為5’GCCGAGCTC-ATGAAGTTTCAACCATTAGG3’，P2的序列為: 5’CCGCTCGAGGTGTTTTTTGTGATCATGAC-3’。P1引物中引入了SacⅠ酶切位點，P2引物中引入XhoⅠ酶切位點。

2.方法

(1)Hp染色體DNA的提取 將Hp標準菌株經布氏肉湯培養(yǎng)液進行培養(yǎng)增菌后，取增菌后的菌液按照DNA提取試劑盒說明進行染色體DNA的提取。

(2)HspA基因的擴增 在50 μl反應體系中，分別加入dNTP 4 μl，基因組DNA（作為模板）3 μl及濃度各為20μmol/L的P1和P2引物各0.5μl，以及PrimeSTAR聚合酶0.5 μl，按照下列條件進行PCR擴增，即98℃變性2 min，然后98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，共32個循環(huán)，最后一個循環(huán)結束后再72℃延伸2 min。所獲PCR產物進行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，同時進行20 g/L瓊脂糖凝膠回收。

(3)重組載體的構建 將純化的PCR產物和載體pET32a(+)，分別以SacⅠ和XhoⅠ雙酶切，并用PCR純化試劑盒進行純化。將酶切純化的目的基因和pET32a(+)按5∶1（摩爾數）比例，在16℃條件下連接過夜。將10 μl連接產物加入一支感受態(tài)細胞中混懸，依次冰浴30 min、42℃水浴90 s、冰浴5 min。最后再在連接產物內加入900 μl LB培養(yǎng)液，于37℃復蘇1 h后離心，棄去上清，余少許培養(yǎng)液與沉淀混勻后接種于LB+氨芐青霉素100 mg/L的平皿上，放37℃孵箱過夜。

(4)重組載體的鑒定 ①PCR鑒定：于次日在平皿上分別挑取單個菌落，以細菌本身為模板進行PCR，反應條件為：94℃變性10 min，然后94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共32個循環(huán)，最后再72℃延伸2 min。所獲PCR產物進行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳。

②雙酶切鑒定基因測序分析：將經菌落PCR初篩為陽性的重組菌接種于5 ml LB+氨芐青霉素100 mg/L培養(yǎng)液中，于37℃以250 r/min培養(yǎng)12 h后，提取質粒進行SacⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，同時將含陽性重組質粒的細菌克隆，送上海英駿生物技術有限公司對插入片段進行序列測定，測序結果與預期一致的重組質粒命名為pET32a(+)/HspA。

(5)重組載體pET32a(+)/HspA在E.coli中的表達 分別將重組載體及載體pET32a(+)轉化E.coli BL21感受態(tài)細胞，隨后挑選含重組載體的單個菌落接種于LB+氨芐青霉素100 mg/L中，于37℃培養(yǎng)A600=0.4～0.6時，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，誘導表達3 h，以10 000 r/min離心2 min。收集菌體，加入等體積蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min，進行SDSPAGE。

結果

1.熱休克蛋白A（HspA）編碼基因的擴增 以Hp基因組DNA為模板進行PCR擴增，所獲PCR產物進行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR擴增產物與實際HspA編碼基因大小相符。

2.重組載體的鑒定 以含重組載體的DH5α菌為模板，按照上述PCR擴增條件進行擴增，所獲PCR產物進行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析（圖1）。結果顯示：以含重組載體的DH5α菌為模板均能擴增出1條約為357 bp的條帶，與實驗設計相一致。

3.HspA基因片段的序列分析 將重組載體以T7為引物進行序列分析（上海英駿生物技術有限公司），并采用電腦DNA分析輔助軟件，對所測定的DNA序列進行同源性分析。結果發(fā)現，插入的目的片段為HspA基因，與GenBank 上公布的HspA核酸序列相比同源性為98%左右。

4.表達產物的SDSPAGE分析 經IPTG誘導后，含重組載體的菌體蛋白可見Mr為33 KD的融合蛋白，含pET32a(+)的菌體蛋白可見Mr約為20 KD的蛋白（圖2）。

3. 經IPTG誘導后含pET32a(+)載體的菌體蛋白；

4. 未經IPTG誘導含pET32a(+)載體的菌體蛋白；5. 陰性對照 

討論

熱休克蛋白(heat shock protein， Hsp)又稱應激蛋白（stress protein， SP），是生物細胞在某些環(huán)境因素或多種應激條件下，誘導合成或合成增加的一類進化上高度保守的應激蛋白質［5］。Hp的HspA是Hp共有的抗原成分，在Hp的致病機制中起著重要的角色，它可介導免疫調節(jié)，觸發(fā)胃上皮細胞的自身免疫反應，在胃黏膜慢性病變的發(fā)展和持續(xù)中充當啟動因子，介導病原與宿主的識別與粘附。另外，由于HspA蛋白序列在不同Hp菌株間高度保守，因此將其單獨使用或與其他抗原聯用，均可激發(fā)機體產生保護免疫，是Hp疫苗的理想組分。所以認為，以熱休克蛋白為基礎的（核酸DNA，或蛋白質）疫苗不失為一種有效的Hp疫苗。

我們成功地將Hp HspA編碼基因進行了克隆，對所構建的重組載體利用重組菌作為模板進行PCR來鑒定，對于PCR陽性的重組菌再進行質粒提取的酶切鑒定和序列分析，提高了重組結果鑒定的效率及準確性。最終經序列分析結果顯示HspA基因全長為357 bp，與GenBank 上公布的hspA核酸序列相比同源性為98%左右。

Hp HspA編碼基因編碼118個氨基酸殘基，相對分子質量為13 KD，由于分子量較小，故我們采用原核表達載體pET32a(+)，其主要特點是，除能夠編碼6個組氨酸殘基外，還帶有可編碼硫氧還蛋白的TrxA基因。外源基因經多克隆位點插入后，可與TrxA基因一起融合表達。融合表達不僅提高了表達產物的穩(wěn)定性，而且由于相對分子質量增大，SDSPAGE更容易分析鑒定。從SDSPAGE的結果表明，含重組載體的菌體蛋白可見Mr為33 KD的融合蛋白，即硫氧還蛋白HspA的分子量約為33 KD，而含pET32a(+)的菌體蛋白可見Mr約為20 KD的蛋白，與硫氧還蛋白的分子量相符。另外，由于原核表達載體pET32a(+)的6個組氨酸殘基可與Ni+NTA瓊脂糖樹脂中Ni2+結合，從而利于對表達產物進行純化。而外源蛋白與硫氧還蛋白之間具有腸激酶和凝血酶識別位點，從而也方便了外源蛋白與硫氧還蛋白的分離。

在本研究中，我們成功地克隆了Hp HspA編碼基因，構建了重組載體并進行了表達，為今后制備安全、高效的疫苗，以及制備ELISA等快速診斷試劑盒提供了基礎。

參考文獻

［1］Pounder RE， Ng D. The prevalence of Helicobacter phlori infection in different countrie［J］. Aliment Pharmacol Ther， 1995， 9(Suppl.2):33-39.

［2］Suganuma M， Kurusu M， Okabe S， et al. Helicpbacter pylori membrane protein 1: a new carcinogenic factor of Helicobacter pylori［J］. Cancer Res， 2001， 61:6356.

［3］Loughlin MF. Novel therapeutic targets in Helicobacter pylori［J］. Expert Opin Ther Targets 2003，7:725-735.

［4］Lamarque D， M Peek R Jr. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection［J］. Helicobacter 2003，8(Suppl 1):21-30.

［5］Ning XX， Wu KC， Shi YQ， et al. Construction and expression of gastric cancer MG7 mimic epitopic fused to heat shock protein 70［J］. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2001，9:892-896.

(收稿日期：2007-08-08 修回日期：2007-10-17）

(編輯：梁明佩)

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