硬腭兩維牽張成骨的動物實驗研究

[摘要]目的：通過手術建立犬腭裂實驗動物模型，探討應用自行設計制作的腭骨外固定兩維牽張器關閉硬腭骨裂隙和后退腭骨的可行性。方法：選擇7只年齡在1～1.5歲的健康雜種犬作為研究對象。并采用隨機分組的方法抽取2只為對照組，其余5只作為實驗組。通過手術制造10mm×25mm的人工腭裂模型，觀察對照組能否自然愈合。在實驗組采用自行設計制作的硬腭兩維骨牽張器，通過骨牽張關閉裂隙并延長硬腭骨，觀察牽張過程。結果：實驗犬術后均成活、健康狀況良好，實驗組牽張器固定牢靠，順利關閉約10mm的間隙，硬腭骨延長約12mm，對照組裂隙無明顯變化。結論：設計的硬腭兩維牽張器，具有穩定可靠的牽張作用，可以同時關閉裂隙和延長硬腭骨，為修復腭裂提供了一種新的途徑。

[關鍵詞]兩維牽張器；牽張成骨；腭裂修復；

[中圖分類號]R782.5 [文獻標識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)06－0779－04

先天性唇腭裂是最常見的發育畸形之一，它嚴重影響患者的口腔及牙頜系統的功能，傳統治療是采用腭裂修復術和咽成形術的方法來關閉軟組織裂隙，但是，由于骨缺損的未能修復以及腭裂手術軟組織剝離和骨面裸露及瘢痕的形成，患者往往存在著上頜發育不良和腭咽閉合不全的問題。牽張成骨術(distraction osteogenesis，DO)是應用特定的機械裝置漸進性牽拉離斷的骨段，從而促進新骨形成的一種技術。近年來已被應用于顱頜面外科，并且出現了許多類型的新型骨牽張器。本研究通過手術建立人工犬腭裂模型，并應用自行設計的硬腭兩維牽張器，進行牽張，以期達到關閉硬腭裂隙的同時后退硬腭，縮小咽腔，改善腭咽閉合功能的目的，目前在國內外尚未見類似文獻報道。本文對此進行研究分析，觀察其可行性，探索一種治療腭裂的新方法。

1 材料和方法

1．1 實驗動物及器材：1～1．5歲的健康雜種犬(第四軍醫大學實驗動物中心提供)，性別不限，體重17～20kg，選擇7只無口鼻腔病灶及呼吸系統、消化系統疾病的犬納入實驗，作為研究對象。并隨機抽取2只為對照組，其余5只作為實驗組。國產冠鷹骨鋸、骨鉆。牽張器由西安中邦生物科技公司協助研制。

1．2 實驗方法

1．2．1 腭裂動物模型的建立：實驗動物術前8h禁飲食，以0.15ml／kg體重速眠新注射液+地西泮5mg肌注麻醉，0.5％碘伏液消毒頭面部及口腔，咽腔填塞紗條以隔絕血液流入呼吸道。取雙側第三前磨牙連線經腭中線至硬腭后緣設計“工”字形切口，向兩側翻起組織瓣，注意保護位于雙側第四前磨牙腭側之腭大神經血管束。沿矢狀方向距離腭中縫兩側5mm處行骨切開，長度自硬腭后緣至雙側第三前磨牙連線水平，前端水平骨切開，以小骨鑿輕輕鑿開、撬動切除骨塊，仔細剝離鼻腔側粘膜，繼而切除骨塊后緣附麗軟組織，形成10mm×25mm大小骨缺損。在鼻中隔兩側矢狀方向剖開鼻腔粘膜，暴露鼻腔。按照骨缺損區的形狀切除部分硬腭粘骨膜，用O號線將硬腭創緣與鼻腔粘膜相對縫合，至此，形成硬腭全層洞穿性裂隙。手術后給予肌肉注射青霉素鈉160萬u／天，共5天。術后1周內喂半流質食物，1周后以軟食飼養，術后10天拆除傷口縫線，10周后處死動物觀察干骨標本。

1．2．2 實驗組牽張器植入：實驗組動物在制造裂隙的同時將牽張器調整至牽張板位于骨轉移盤所在的中心位置，鉆孔并標記截骨線。在硬腭裂隙兩側10mm處由前向后以電鋸做平行于裂隙的骨切開，在腭裂前方成“V”形切開，截骨角度約450與縱形截骨線相連，形成“M”截骨線。兩側對稱的骨轉移盤形狀近似平行四邊形，其中寬約10mm，長約25mm。輕輕撬動骨轉移盤，將牽張器兩側固定臂置入粘膜上方并與骨面緊密貼合，將固定臂和牽張板以7mm的微型純鈦螺釘穿通粘骨膜于骨面堅固內固定。仍按照前述方法縫合傷口，術后處理與喂養與實驗對照組相同，術后10天拆線，12天后開始加力進行牽張(圖1、2)。

1．2．3 實驗組牽張整復：在牽張器植入手術后12天開始加力，此階段為牽張前的間歇期。先旋轉矢狀轉盤，后旋轉水平轉盤。以矢狀轉盤每次旋轉一圈，水平轉盤每次1/2圈的速度牽引，每天牽張兩次，合計牽張距離為向后延長0.8mm，向近中每側牽張0.4mm，裂隙縮小0.8mm。13天左右可關閉寬約10mm的裂隙，后退硬腭10mm。此時繼續按此牽張頻率單獨旋轉矢狀轉盤，向后延長硬腭。繼續后退2mm后結束牽張，原位固定保持10周后處死，以4％多聚甲醛液經頸動脈灌注，取材進研究。

1．2．4 三維CT重建：分別在牽張前及牽張保持期后進行CT三維重建，觀察硬腭骨形態改變及成骨情況。

1．2．5 組織學研究：標本為牽張區新生骨組織及部分正常骨組織，切割為10mm×10mm大小組織塊，20％甲酸脫鈣，常規脫水，石蠟包埋，沿牽張方向水平及冠狀切片(0.5μm厚度)，經HF、Masson三色染后，光學顯微鏡觀察并拍攝照片。

2 結果

2．1 牽張前觀察：實驗動物均順利完成手術。術后第一天以少量流食為主，進食緩慢，容易鼻腔返流，出現噴嚏嗆咳等刺激癥狀，吠聲鼻音較重，與人類腭裂患者臨床表現相似。兩組動物均成活至實驗結束。口內檢查硬腭部分可見10mm×25mm的全層洞穿裂隙，創口無出血及感染跡象，牽張器固定牢靠，對飲食呼吸及咬合無明顯影響。

2．2 對照組觀察：雖然實驗犬隨著對裂隙的適應，返流及嗆咳現象有所好轉，但術后觀察硬腭部全層缺損一直保持原有大小及形態，裂隙邊緣口腔粘膜與鼻腔粘膜愈合良好。10周處死后觀察裂隙全層缺損仍存在，證實10mm×25mm的裂隙無法自然愈合。建立了長期穩定的犬腭裂骨質缺損的實驗動物模型。

2．3 實驗組觀察：術后10天拆除縫線見裂隙邊緣傷口愈合良好，牽張器牢靠，可以正常牽張。牽張過程中，傷口無裂開，裂隙逐漸縮小。牽張13天后，裂隙已完全閉合，水平轉盤牽張阻力明顯增大，但矢狀轉盤仍可順利旋轉向后延長硬腭，牽張15天，硬腭延長約12mm后，停止牽張，進入保持期。此時動物進食時的鼻腔返流和嗆咳現象已完全消失。咬合關系未見異常。保持期中，牽張器固定螺釘穿粘膜處有局限性壞死現象，但是經過每天螺釘周圍碘伏消毒處理，發現壞死僅限于粘膜表層，對實驗結果沒有影響。牽張器固定良好，無松動脫落。硬腭后部裂隙已消失，僅見軟腭有一直徑約7mm的軟組織缺損。裂隙邊緣的粘膜在持續性壓力作用下，已經部分粘連愈合，僅見條狀瘢痕(圖3)。

2．4 組織學觀察：HE染色示牽張區域有沿牽張方向排列的骨小梁結構且已鈣化成熟，形成較均勻一致的成熟板層骨結構，其間可見較活躍的骨改建現象，骨小梁周圍有較多的成骨細胞和破骨細胞，較成熟的哈佛氏系統已經形成。Masson三色染色可見骨小梁鈣化程度較高，顯示較均勻的皮質骨形態，骨小梁排列較亂。骨細胞較舊骨區域多，新舊骨交界處的界線已不明確。

2．5 CT掃描結果：牽張完成后10周，拆除牽張器后兩周，水平CT掃描可見，新生骨位于水平及矢狀牽張區內，基本完全骨化，骨質密度與正常骨類似。三維CT重建可見雙側骨轉移盤已轉移至裂隙中央，且明顯后退，但邊緣較原來略有吸收，仍可見牽張器拆除后遺留的固位釘孔，新生骨略高于正常骨表面(圖4)。

2．6 大體標本觀察：肉眼觀察標本，見硬腭骨裂隙已經消失，硬腭結構連續。牽張區為大量新生骨樣結構組織，與轉移盤及硬腭骨組織連續。新生骨厚約0.5～1.0mm，較正常腭骨薄，且表面粗糙不平。

3 討論

3．1 腭裂現今的治療仍以手術修補為主，然而腭裂修復術是通過移位腭部軟組織至裂隙處愈合而封閉裂隙，術后形成的瘢痕不但影響術后的腭咽閉合而且被認為是造成上頜骨發育不全的主要原因。據調查腭裂術后的腭咽閉合不全發生率為4.5％～39％。術后的語音治療只能減少部分癥狀，仍以手術治療為主，如腭延長術，咽后壁瓣咽成形術，腭咽肌瓣咽成形術。然而沒有臨床證據表明哪一種方法最適合于腭咽閉合不全的治療，而且它們均是采用軟組織瓣的轉移，造成腭咽部生理解剖的改變，且隨著各種瘢痕的產生和瓣的萎縮，很多患者術后仍遺留有嚴重的發音異常。目前，國內外學者利用牽張成骨技術治療腭裂已取得一定進展。柳春明1999年首次采用記憶合金牽張犬腭骨外側縫，成功關閉了人工形成的硬腭裂隙。梁立民在2002年采用縫牽引技術，使用記憶合金牽引器成功關閉了寬8mm長25mm的犬腭裂模型，并向后延長了腭骨，且未對上頜骨發育造成影響。陳剛等在2003年采用新設計的口內腭裂牽張裝置成功關閉了寬5mm、長15mm的貓腭裂模型。陽金楚在2003年應用自制的腭部牽張裝置成功延長了腭裂模型犬的腭部，證明了后退腭骨的可行性。張浚睿在2003年采用自行研制制作的牽張裝置成功關閉了寬8mm、長30mm的犬人工腭裂模型。Carls等，Ascherman和Tibesar等分別采用切開牽引成骨的方法，單獨實現了延長硬腭和關閉裂隙。至今仍無文獻報道采用切開牽引成骨的方法，同時完成關閉裂隙及延長硬腭的牽張實驗。本研究正是根據腭裂特點和功能性修復需要，從新的思路進行全新的設計。

3．2 我們選擇犬作為實驗動物，主要考慮到犬硬腭骨后部寬闊、平坦，且骨質約有1mm左右的厚度，牽張器以螺釘固定后牢固且穩定性良好。兩側第四前磨牙腭側有解剖穩定的腭大神經血管束，保證了手術中選擇切口、翻瓣及形成骨轉移盤時組織具有良好的血運。犬的口裂大，能處于很大的開口狀態，清晰地暴露硬腭后部及軟腭，使手術操作及后期牽張器加力、觀察更加簡便、易行。由于犬硬腭厚度小于3mm，而實驗中形成的硬腭骨裂隙寬度達10mm，長度達25mm，已經超過了自身的愈合能力，加之手術將裂隙兩側的粘骨膜與鼻粘膜相對縫合，形成了軟組織的屏障，使腭骨缺損區完全修復無法完成。另外很多相關研究。也都證明了犬腭裂模型的可靠性。為排除實驗動物人造腭裂模型自行愈合的可能性，我們在實驗中也設置了對照組。通過觀察，在10周的實驗期內，對照組犬硬腭骨缺損沒有自行愈合，且有增大的趨勢，說明實驗中建立的犬腭裂動物模型的有效性。

截骨的方式和方向對牽張成骨的質和量有很大的影響。本實驗中設計了“M”形截骨線，通過雙側縱形截骨，形成兩個平行的骨轉移盤，其移動的支抗由硬腭骨前部提供。由于是“M”形截骨線，在骨轉移盤向近中移動的同時，實現了硬腭的后退，這樣可以減少牽引的距離。骨轉移盤在移動時牙槽骨及牙列不受應力作用，有效的避免了對牙弓和頜骨發育的影響。在截骨時要注意分離翼突與上頜結節的連接可以使翼突尾部與鉤突、硬腭后部與軟腭肌肉一起移動。

3．3 牽張開始的時間對骨形成有影響，術后立即牽張，產生的間隙可能抑制成骨先驅細胞的增殖，同時也可能抑制損傷血管的修復，故許多學者都強調間歇期、牽張速率及頻率對牽張成骨成功的重要性。間歇期實際上是骨折修復的早期階段，骨外膜和骨內膜的成骨細胞參與修復，加上骨斷端問有血供良好的肉芽組織，即便骨內血管切斷了，有間歇期血循環也可在牽張前恢復。但是，獲得最大成骨活性的理想間歇期尚不清楚，犬硬腭骨為板狀的皮質骨且較薄，適當延長間隔期，可以在骨切開處形成血供良好的肉芽組織，且保證傷口的順利愈合。在Carls的研究中發現犬硬腭切開后，18天后就形成了再次骨化，而無法牽張。因此推薦間歇期為10～12天，我們選擇了12天的間歇期，研究發現可以成功成骨，而且沒有骨轉移盤的吸收和口鼻瘺的形成。本研究在牽張速率的選擇上嚴格遵循IliZarov的張力拉力法則，每次硬腭后退0.4mm，近中移動0.2mm，頻率2次/日。也就是說在緩慢穩定牽引力作用下，機體組織成為具有代謝活性的以增生和細胞生物合成功能被激活為特征的狀態。這種再生過程與適當的血供和刺激作用的大小有關，這也是牽張成骨的生物學基礎。在截骨中需要保護骨質的血供，以確保穩定的骨質形成，在長骨中可以采用骨皮質切開以保護骨髓的血供，此外也強調保護骨膜的重要性。而對于硬腭來說，其血供主要來源于腭大動脈和硬腭的粘骨膜和鼻腔側粘膜。實驗中我們發現將腭大動脈留在轉運盤上往往很困難，大大增加了手術操作的難度。但是只要在截骨過程中保護鼻側粘膜與骨片的附麗完好，就可以保證轉運盤的血供。此外牽引力的穩定性也是能否生成新骨的決定條件，否則只能是纖維結締組織和軟骨的增生。在牽張器的設計中，增加了“L”形的固定臂和將移動桿設計為方形，以防止牽張過程中的牽張板的旋轉和擺動，保證新骨的形成。

3．4 對于外置型牽張器，最常見的并發癥就是感染、松動和口鼻瘺的形成，導致牽張失敗。在實驗中我們發現牽張器固定螺釘穿粘膜處有局限性壞死現象，研究后表明這是由于局部壓迫而導致的粘膜表層壞死并未向深層發展，牽張器拆除后一周左右可以自行愈合。為預防感染在手術中嚴格無菌操作，間歇期每天使用0.5％的碘伏進行硬腭沖洗，保持期每周沖洗兩次，這樣有效的避免了感染的發生。此外堅固內固定要足夠牢靠，防止松動，嚴格按照牽張法則進行牽張，牽張后要有足夠的保持期，可以有效防止口鼻瘺的形成。我們在實驗中為使牽張器固定牢固，采用先按截骨線將骨截除一定的厚度，安裝牽張器后輕輕晃動使轉移盤與腭骨分離，故實驗在手術操作上要求較高，有一定難度。

3．5 骨牽張可以向后延長軟腭組織，但是仍然沒有相關的報道表明是否能夠真正的對語言的改善有幫助，在本研究中犬的咽腔結構不能滿足對腭咽閉合狀態的觀察研究，只是探討了采用DO技術延長腭骨是完全可行的，在將來的臨床實驗中，可以將選擇合適的實驗對象進行鼻咽纖維鏡和精確頭影測量，來精確評價在牽張期硬腭，軟腭和腭咽閉合的變化。此外犬硬腭形態與人類存在很大的差異，而人類的硬腭成拱形結構，牽張器的設計以及裝置放置的位置和方向都需要進一步研究。