自體移植皮片中黑素細胞的密度和功能變化

[摘要]目的：通過對自體移植皮片中黑素細胞密度和功能變化的測定，進一步認識黑素細胞密度變化在自體移植皮片過度色素沉著中的作用。方法：利用免疫組織化學方法測定自體中厚移植皮片黑素細胞中特異性抗原顯示黑素細胞，計算表皮中黑素細胞的密度，并與自體正常皮膚對照；利用銀染－麗春紅法檢測自體中厚移植皮片和正常皮膚中黑素含量。結(jié)果：自體移植皮片與自體對照正常皮膚中黑素細胞的密度差異無顯著性(P＞0.05)；自體中厚移植皮片中黑色素含量較自體正常對照皮膚中的黑色素含量明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。結(jié)論：自體皮片移植后表皮中黑素細胞密度無明顯變化，與皮片色素沉著程度無顯著相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞]自體移植皮片；黑素細胞；過度色素沉著

[中圖分類號]R622 [文獻標識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)06－0731－03

自體皮片移植是整形外科常用的手術(shù)方法之一，但皮片移植成活后常伴有不同程度的過度色素沉著。國內(nèi)外許多學者對皮片移植后過度色素沉著的機制作了研究，其中對于皮片移植后黑素細胞數(shù)量的變化有著不同的看法。本實驗通過測定人體自體中厚移植皮片中黑素細胞的密度變化，以及自體中厚移植皮片中黑素含量的變化，進一步澄清黑素細胞密度的變化在自體移植皮片過度色素沉著中的作用。

1 材料和方法

1．1 實驗標本：本組實驗所需標本均取自頸部自體中厚皮片移植術(shù)后1年，局部需再次手術(shù)的患者。取自體中厚移植皮片23例，同時在每例移植皮片受區(qū)及原供區(qū)腹部周圍分別切取正常皮膚作對照。患者年齡7～34歲，男16例，女7例。所取標本的患者均無垂體腎上腺疾病、傳染病、皮膚病及免疫性疾病，局部無感染、潰瘍，術(shù)前未應(yīng)用激素及免疫抑制劑治療，局部亦未曾行放射治療。標本切取后在半小時內(nèi)放入液氮瓶，然后置－80℃冰箱保存。1．2主要試劑：Mel－5單克隆抗體：美國SignetLaboratories Inc產(chǎn)品；Envision免疫組化染色試劑盒：美國Dako公司；DAB：美國Sigma公司等；Fontana銀液；氯化金；麗春紅(Ponceau)(上海天平化學試劑廠)；JVC彩色攝像頭(TK－C1381，JVC公司，日本)；彩色病理圖像分析系統(tǒng)(四川大學圖像圖形研究所)。

1．3 免疫組化步驟：切片脫蠟至水，每張切片加過氧化酶阻斷劑(3％H₂O₂)50μl，作用10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；切片浸入0.01mol/L PBS緩沖液中，微波處理10min：每張切片加鼠抗人Mel－5單克隆抗體50μl，37℃條件，作用60min：每張切片加Envision試劑50μl，37℃條件，作用30min；以上各步驟均經(jīng)0.01mol/L PBS(pH7.4)沖洗，5min×3次；然后將切片置新鮮配制的0.01％DAB/0.03％H202顯色液中顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復染1min；脫水，透明，中性樹膠封片。同時用PBS代替Mel－5單克隆抗體作陰性對照。

1．4 Masson Fontana－Poneeau染色：各組標本石蠟包埋后，切片脫蠟至蒸餾水浸洗，再浸入Fontana銀液15h；蒸餾水及時浸洗2次，氯化金處理2min：蒸餾水浸洗2次，Ponceau處理3min：無水乙醇脫水，過濾紙吸干；二甲苯透明和中性樹膠封閉；鏡檢，黑色素定位于表皮黑素細胞、角朊細胞胞漿。膠原纖維呈紅色，背景淡黃色；拍照，掃描成像分析儀處理系統(tǒng)進行光密度掃描。

1．5 統(tǒng)計學處理：實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較用t檢驗，使用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包處理，P＜0.01為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 免疫組化染色結(jié)果：Mel－5免疫標記物定位于基底部黑素細胞胞漿，為黃或棕黃色顆粒，呈局灶性或彌漫性分布(圖1)。各組標本中每200個基底細胞中平均陽性細胞數(shù)為：自體中厚移植皮片組28.4±3.2；皮片原供區(qū)正常皮膚組26.8±4.5；皮片受區(qū)周圍正常皮膚組27.6±4.1。自體中厚移植皮片組中黑素細胞密度與皮片原供區(qū)和受區(qū)周圍正常皮膚中黑素細胞密度相比，其差異性不顯著(P＞0.05)；皮片受區(qū)周圍正常對照皮膚與原供區(qū)腹部正常對照皮膚中黑素細胞密度的差異亦無顯著性(P＞0.05)

2．2 Masson Fontana－Ponceau染色結(jié)果：黑色素呈黑色，定位于表皮黑素細胞、角朊細胞胞漿，膠原纖維呈紅色，背景呈淡黃色。在白體中厚移植皮片表皮基底細胞中黑素含量較皮片原供區(qū)和受區(qū)周圍正常皮膚中明顯增多；皮片表皮基底層黑素細胞中黑素小體明顯增多，在突起未端亦見黑素小體增多，與黑素細胞相鄰近的角朊細胞中黑素顆粒明顯增多且位于角朊細胞細胞核的上方，在棘層和顆粒層細胞中可見少許黑素顆粒(圖2)，經(jīng)計算機掃描計算各組灰度值為：自體中厚移植皮片組為0.73±0.07；皮片原供區(qū)正常皮膚組為0.24±0.03；皮片受區(qū)周圍正常皮膚組為0.29±0.06。自體中厚移植皮片組中黑素含量與皮片原供區(qū)和受區(qū)周圍正常皮膚中黑素含量相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；皮片受區(qū)周圍正常對照皮膚與原供區(qū)腹部正常對照皮膚中黑素含量相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)

3 討論

自體皮片移植是整形外科常用的手術(shù)方法之一，但移植皮片成活后常伴有不同程度的過度色素沉著，從而影響了手術(shù)效果。如何防治自體皮片移植后過度色素沉著，至今仍是困擾整形外科醫(yī)生的一道難題，主要原因是其確切發(fā)生機制尚未闡明。

對于自體皮片移植后呈過度色素沉著現(xiàn)象許多學者作了研究，提出了許多重要的理論，但在自體皮片移植后表皮中黑素細胞的密度變化在皮片過度色素沉著中的作用，存在不同的看法。此前亦有研究表明，黑素細胞來源于胚胎時期的神經(jīng)嵴細胞，分化程度高，通過有絲分裂增殖的可能性較小，不同種族的人正常皮膚中黑素細胞數(shù)大體上是相同的，但黑種人角朊細胞內(nèi)黑素體數(shù)量多、形大、黑素化程度深，單個散在分布、降解緩慢。而來自白種人則相反，黑素體量少、形小、黑素化程度輕，多聚集分布于吞噬溶酶小體內(nèi)，容易發(fā)生降解，這些表現(xiàn)及過程與遺傳因素有關(guān)，并受多種基因的調(diào)控。但亦有人又觀察到在皮膚慢性炎癥或損傷后，處于炎性環(huán)璄中的黑素細胞可發(fā)生有絲分裂進行增殖，并可發(fā)生黑素細胞的移行。

為觀察自體中厚移植皮片在經(jīng)歷了組織損傷、修復，炎性反應(yīng)基本穩(wěn)定后，其表皮黑素細胞的密度變化與皮片呈過度色素沉著表現(xiàn)是否具有相關(guān)性，本研究利用75KDa的色素相關(guān)糖原蛋白特異性存在于表皮黑素細胞中參與黑素的合成，通過免疫組化方法使用特異性的單克隆抗體Mel－5與表皮黑素細胞中75KDa的色素相關(guān)糖原蛋白抗原相結(jié)合，顯示黑素細胞；結(jié)果表明，黑素細胞密度變化在自體中厚移植皮片與正常對照皮膚之間無顯著差異，供區(qū)與受區(qū)部位正常對照皮膚之間黑素細胞數(shù)量的差異亦無顯著差異性，說明白體皮片移植后雖經(jīng)歷了組織的損傷、修復及炎性反應(yīng)過程，黑素細胞的密度無明顯變化。同時利用銀染一麗春紅法檢測自體中厚移植皮片和正常皮膚中黑素含量，顯示在自體中厚移植皮片表皮中黑素含量較正常皮膚中明顯增多，從大體上亦觀察到皮片呈過度色素沉著表現(xiàn)。從細胞形態(tài)學上觀察亦可知，自體皮片移植后表皮中黑素細胞分支狀樹突增多，與周圍基底細胞連接緊密；角朊細胞亦表現(xiàn)為胞體肥大，核淡染，核周出現(xiàn)透明區(qū)，與黑素細胞連接緊密，表明白體皮片移植后表皮中黑素細胞、角朊細胞的結(jié)構(gòu)特征發(fā)生了變化，相應(yīng)細胞的功能亦可能會發(fā)生變化。至于本實驗觀察到皮片表皮中黑素細胞密度變化與李海洋等觀察的結(jié)果不一致，也許是兩者觀察的時間差異所致，本組實驗所取標本均為術(shù)后一年，移植皮片的組織損傷、修復及炎性反應(yīng)基本穩(wěn)定，而后者的觀察時間是術(shù)后三月內(nèi)，移植皮片的組織損傷、修復及炎癥反應(yīng)可能還未完全消退，表皮黑素細胞還處于從損傷到恢復、增殖的過程中，其后續(xù)變化情況可進一步研究觀察。

在此前研究中我們觀察到自體中厚移植皮片a－MSH及其受體的表達明顯增強，在自體移植皮片過度色素沉著過程中起重要調(diào)控作用。研究表明a－MSH及其受體的表達上調(diào)通過G蛋白與腺甘酸環(huán)化酶偶聯(lián)增加細胞內(nèi)cAMP含量，蛋白激酶被激活，酪氨酸酶生成增多，活性增強，黑素合成增加并使黑素體擴散，且主要是優(yōu)先刺激合成優(yōu)黑素并促進黑素體擴散，在黑素細胞、角朊細胞內(nèi)呈“核上帽”形成分布，從而使皮膚的色素沉著明顯。由上可知，自體移植皮片在經(jīng)歷組織的損傷、修復及炎癥反應(yīng)過程后，其表皮中黑素細胞功能增強、表皮中黑素含量明顯增多，是導致皮片呈過度色素沉著表現(xiàn)的主要原因，其基底層黑素細胞的密度無明顯變化，故自體皮片移植后呈過度色素沉著表現(xiàn)與黑素細胞的密度變化無明顯相關(guān)性。