組織化學(xué)技術(shù)在體育科研中的應(yīng)用

摘要：從普通組織化學(xué)、酶組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)、原位雜交組織化學(xué)及定量組織化學(xué)等方面對國內(nèi)外組織化學(xué)技術(shù)在體育科研中的應(yīng)用研究進行了綜述。隨著現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，在體育科學(xué)研究中普通組織化學(xué)方法逐漸退出而被其它更高效、精確的檢測手段如免疫學(xué)方法及定量組織化學(xué)方法等技術(shù)代替。其中，流式細胞技術(shù)、激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)和免疫電鏡技術(shù)等先進組織化學(xué)技術(shù)在體育科研中日益顯示出其巨大的應(yīng)用潛力，并為此方 面的研究提供豐富、穩(wěn)定、可靠、準(zhǔn)確的研究平臺。

關(guān)鍵詞：組織化學(xué)技術(shù)；體育科研；綜述

中圖分類號：G804.7 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-7116(2007)06-0044-04

組織化學(xué)是運用組織學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等原理與技術(shù)，對組織與細胞的化學(xué)成分、化學(xué)反應(yīng)及其變化規(guī)律進行定性、定位和定量研究的科學(xué)。目前組織化學(xué)技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于體育科學(xué)研究當(dāng)中。本文主要是就目前在體育科研中仍然繼續(xù)沿用并不斷發(fā)展更新的一些組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用進行闡述，以促進此領(lǐng)域研究的進一步深入。

1 普通組織化學(xué)技術(shù)

普通組織化學(xué)技術(shù)是指以常用的組織化學(xué)技術(shù)，對細胞內(nèi)主要化學(xué)成分和活性的粗略(一般性)的研究。目前在體育科研中，多數(shù)用于形態(tài)觀察或常規(guī)組織學(xué)觀察。如對負(fù)離心定量運動訓(xùn)練大鼠的骨骼肌方面組織學(xué)變化(肌纖維數(shù)目密度變化)及損傷程度研究Ⅲ和探討內(nèi)服、外用中藥對家兔小腿前群肌肉離心訓(xùn)練后肌肉形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和細胞學(xué)的影響等。除對肌肉組織學(xué)觀察的研究較多以外，還有一些研究涉及其他器官，如腎臟、性腺等。相關(guān)報道有趙汝珠等研究中藥抗疲I號對雌性、雄性訓(xùn)練Wistar大鼠急進高原并運動力竭后性激素和卵巢、睪丸的防護作用，并對性腺行HE染色進行病理學(xué)光鏡觀察等。總之，普通組織化學(xué)技術(shù)在體育科研中主要用于形態(tài)學(xué)觀察，一方面從組織與細胞水平分析運動對各臟器的形態(tài)學(xué)及組織學(xué)影響；另一方面，又為相應(yīng)的生理功能變化發(fā)生機理提供佐證或進一步研究的參考。

2 酶組織化學(xué)技術(shù)

酶組織化學(xué)(Enzyme Histochemistry)技術(shù)是利用組織細胞內(nèi)酶具有催化某種反應(yīng)的特性來檢測酶活性。一般是用凍結(jié)或固定的切片，在一定條件下(具有酶的底物等)全酶進行催化作用，產(chǎn)生一種可見產(chǎn)物，沉淀在酶所在的部位，最終通過顯微鏡對酶的活性進行定位或定量研究。其特點是在原位檢測，且檢測酶的活性而不是酶分子本身。

荷蘭Koopman R等采用酶組化方法測定不同肌纖維中S6KI的磷酸化狀態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)人體骨骼肌在抗阻訓(xùn)練后，S6K1的磷酸化增加主要發(fā)生在Ⅱ型肌纖維。還有應(yīng)用酶組織化學(xué)方法反映骨骼肌的生理狀態(tài)的研究，如黃慶愿等通過酶組織化學(xué)方法檢測肌球蛋白ATP酶(myosin-ATPase)從而觀察缺氧及在缺氧條件下運動對大鼠腓腸肌肌纖維形態(tài)和毛細血管的影響。此外，酶組織化學(xué)方法還應(yīng)用于運動實踐中物質(zhì)代謝和能量代謝等方面。如，用以研究未習(xí)服熱暴露附加運動負(fù)荷(游泳)動物的過氧化脂質(zhì)(LPO)、超氧化物歧化酶(SOD)的變化。

可見，酶組織化學(xué)技術(shù)在體育科研中主要用于檢測機體生物化學(xué)反應(yīng)過程中具有代表性或限速性的關(guān)鍵酶，從而分析機體生理功能狀態(tài)，尤其是物質(zhì)代謝、能量代謝、氧自由基等方面。

3 免疫組織化學(xué)技術(shù)

免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry)技術(shù)是組織化學(xué)的分支，是用標(biāo)記的特異性抗體(或抗原)對組織內(nèi)抗原(或抗體)的分布進行組織和細胞原位檢測技術(shù)。此技術(shù)在不斷更新檢測手段和克服自身不足中日趨完善，呈現(xiàn)出其他技術(shù)無法比擬和替代的優(yōu)勢。

在神經(jīng)(腦)研究方面，主要有通過免疫組化sP法觀察不同動情周期、不同訓(xùn)練強度時雌性大鼠下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)和β-內(nèi)啡呔(β-EP)免疫反應(yīng)陽性細胞的定量變化的研究，采用免疫組化ABC與SABC法研究下丘腦腹內(nèi)側(cè)核和背內(nèi)側(cè)核、室旁核和視上核、杏仁體核簇、海馬CA₁區(qū)中神經(jīng)型(nNOS)、誘導(dǎo)型(iNOS)、內(nèi)皮型(eNOS)一氧化氮合酶與不同運動模式或狀態(tài)之間的關(guān)系。所以免疫組化技術(shù)在研究神經(jīng)遞質(zhì)/調(diào)質(zhì)，神經(jīng)內(nèi)分泌激素，以及其他生物活性物質(zhì)的定性、定量、定位分析方面起著非常重要的作用。

另外，免疫組化技術(shù)在研究心肌與骨骼肌的各種生物活性物質(zhì)及細胞凋亡方面也有重要的應(yīng)用。Delchev SD等噪用免疫組織化學(xué)方法研究亞強度運動后大鼠心肌細胞線粒體膜酶活性的變化。國內(nèi)有通過免疫組化ABC法研究不同強度運動訓(xùn)練對心臟內(nèi)分泌功能(血漿ANP的含量和心肌組織中ANP的表達)的影響的報道。此外，免疫組織化學(xué)技術(shù)還應(yīng)用于觀察運動應(yīng)激對吸煙大鼠支氣管平滑肌大電導(dǎo)的鈣激活的鉀通道(BK_Ca)和電壓依賴性延遲整流鉀通道Kvl5蛋白表達的影響等方面。

從上述可見，免疫組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用范圍極其廣泛，凡是組織細胞內(nèi)具有抗原性的物質(zhì)，如肽類、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細胞因子、受體、表面抗原等均可用免疫組織化學(xué)方法顯示，并且可以對所研究的大分子物質(zhì)進行定位、定性與定量分析，進而深入研究其功能，綜合分析其作用機理。因此目前在體育運動領(lǐng)域的基礎(chǔ)理論與實踐應(yīng)用科研中都被廣泛運用。

4 原位雜交組織化學(xué)技術(shù)

原位雜交組織化學(xué)(In Situ Hybridization Histo-chemistry)技術(shù)是基于利用標(biāo)記物f熒光素、酶、重金屬離子等)或放射性核素(已少用)作為示蹤劑，通過核酸雜交(堿基配對特異性連接)途徑，在組織切片或細胞涂片上，原位顯示生物大分子物質(zhì)基因表達的動態(tài)變化而建立的一門組織化學(xué)技術(shù)。基本特點是“特異、靈敏、準(zhǔn)確、原位”，是分子生物學(xué)研究的常用手段。如Holmes PV等采用原位雜交組織化學(xué)技術(shù)對不定量隨意運動和抗抑郁藥物一海地芬治療提高促生長激素神經(jīng)肽中mRNA水平影響的研究。Timofeeva E等采用原位雜交組織化學(xué)技術(shù)研究跑臺運動對大腦興奮性與促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素系統(tǒng)的影響。而國內(nèi)有通過原位雜交的方法結(jié)合圖像分析，觀察運動訓(xùn)練中不同負(fù)荷和運動后不同恢復(fù)時相的大鼠腦組織一氧化氮合酶(NOS)和ET-1 mRNA的表達的研究報道另外，采用原位雜交組織化學(xué)技術(shù)研究低氧訓(xùn)練對大鼠骨骼肌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因表達的影響等。至此，原位雜交組織化學(xué)技術(shù)突破了組織化學(xué)分子水平研究的瓶頸，為原位研究各種運動狀態(tài)下相關(guān)基因的變化提供了有力的手段。

5 定量組織化學(xué)技術(shù)

隨著現(xiàn)代物理學(xué)的飛速發(fā)展，新理論新技術(shù)不斷出現(xiàn)，發(fā)明了一批新的儀器，從而使組織、細胞的化學(xué)成分提高到定量分析的水平。最常用的有顯微分光光度計、流式細胞儀、激光掃描共聚焦顯微鏡等。

1)流式細胞儀。流式細胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的先進科學(xué)技術(shù)，具有分析和分選細胞功能。它不僅可測量細胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀，還可檢測細胞表面和細胞漿抗原、細胞內(nèi)DNA、RNA含量等；可對群體細胞在單細胞水平上進行分析，在短時間內(nèi)檢測分析大量細胞，并收集、儲存和處理數(shù)據(jù)，進行多參數(shù)定量分析；也能夠分類收集(分選)某一亞群細胞，分選純度＞95％。FCM以其快速、靈活、大量、靈敏和定量的特色，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用實踐，在體育科研中發(fā)揮著重要的作用。近年來，在免疫方面的研究有運用流式細胞技術(shù)探討免疫參數(shù)與測試對象的身體素質(zhì)、技術(shù)水平和機能狀態(tài)關(guān)系的研究報道，還有應(yīng)用流式細胞儀檢測紅細胞CD35來探討HiHiLo對機體紅細胞CD數(shù)量及活性的影響研究。

此外，流式細胞術(shù)還廣泛應(yīng)用于研究心肌和骨骼肌細胞凋亡并取得喜人的成果，同樣Lagranha CJ等結(jié)合使用流式細胞術(shù)與熒光顯微技術(shù)探討補充谷胺酰胺對運動引起大鼠中性粒細胞凋亡的影響進行分析。Ding YH等使用流式細胞儀做運動預(yù)處理提高心臟局部缺血大鼠大腦整合機能的研究。

2)激光掃描共聚焦顯微鏡。激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope，LSCM)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項具有劃時代意義的高科技新產(chǎn)品。與免疫熒光組化結(jié)合，實現(xiàn)了對細胞內(nèi)部非侵入式光學(xué)斷層掃描成像，從而對被檢物體樣品從停留在表面單層、靜態(tài)平面的觀察進行到立體、斷層掃描、動態(tài)全面的觀察，在生命科學(xué)研究中得到迅速應(yīng)用。其性能特點是分辨率高、靈敏度高、掃描速度快、掃描范圍大、圖像存取方便，可進行“光學(xué)切片”的觀察，可進行定量熒光分析。Higa-Taniguchi KT等采用共聚焦顯微鏡對運動訓(xùn)練導(dǎo)致正常大鼠與高血壓大鼠室旁核內(nèi)腎上腺素能分布變化的影響進行研究。常蕓等應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡與新一代鈣熒光指示劑Fluo-3AM負(fù)載方法觀察心肌活細胞內(nèi)具有生物活性的游離鈣的動態(tài)變化，從而探討運動心臟結(jié)構(gòu)與功能的發(fā)生、轉(zhuǎn)歸及其與病理心臟的本質(zhì)差異。

組織化學(xué)技術(shù)是一門龐大復(fù)雜、綜合全面的分析技術(shù)，具有很強的外延擴展性，隨著組織學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科的不斷發(fā)展，也會不斷地擴展其研究手段和方法。而這些方法手段在體育科研中有廣闊的應(yīng)用前景，它將為此方面的研究提供豐富、穩(wěn)定、可靠、準(zhǔn)確的研究技術(shù)。如流式細胞技術(shù)的廣泛應(yīng)用，能在單細胞水平上，大量地、多參數(shù)地定量分析與運動機能相關(guān)的指標(biāo)，為運動訓(xùn)練和健身運動的科學(xué)合理安排提供重要的參考依據(jù)。而激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)能使研究更深入到立體、斷層、動態(tài)的分析水平。另外，目前在運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域還沒有得到廣泛應(yīng)用的免疫電鏡技術(shù)，能夠更好地從亞細胞水平研究分析運動生理功能。以上幾項各有優(yōu)勢的實驗技術(shù)將在體育科學(xué)研究領(lǐng)域具有非常良好的應(yīng)用前景，也將是研究的熱點。相信先進的組織化學(xué)技術(shù)在體育科研中的充分應(yīng)用，必將促進此領(lǐng)域分子水平研究的快速提高。

[編輯：鄭植友]