甜櫻桃矮化砧木ＲＵＳ－２５離體葉片再生植株技術(shù)研究

摘要：利用甜櫻桃矮化砧木RUS-25無(wú)菌試管苗的葉片作外植體，進(jìn)行離體葉片再生植株研究。結(jié)果表明。培養(yǎng)條件、激素種類和配比均影響不定芽的再生，最適宜的激素配比為MS-F6-BA 2.0mg/L+IBAO.5mg/L+NAA 0.2mg/L，不定芽誘導(dǎo)率為90.3％。

關(guān)鍵詞：甜櫻桃；矮化砧木RUS-25:離體葉片；植株再生。

甜櫻桃矮化砧木RUS-25是俄羅斯選育的一個(gè)砧木品種，1996年引進(jìn)。該砧木根系發(fā)達(dá)、抗寒、抗旱，嫁接甜櫻桃品種后表現(xiàn)為親和力好、樹體矮化明顯、成花結(jié)果早，適用于矮化密植栽培和保護(hù)地栽培。李文金、蔚承祥等對(duì)甜櫻桃矮化砧木RUS-25進(jìn)行了組織培養(yǎng)及提高生根率的研究，建立了穩(wěn)定、高效的組培快繁體系。本研究旨在利用離體葉片誘導(dǎo)產(chǎn)生再生植株，為轉(zhuǎn)基因工程育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

選取生根培養(yǎng)30d(天)的甜櫻桃矮化砧木RUS-25的生根試管苗展開葉片，在超靜工作臺(tái)上剪去葉柄、葉緣及葉尖部的1/3，垂直葉脈橫剪2刀，背面向下平鋪接種在MS附加6-BA、IBA等不同激素濃度的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上(各培養(yǎng)基附加蔗糖30g/L、瓊脂6.0g/L、pH值5.6～5.8，具體見表1)，每個(gè)處理接10瓶，每瓶接種2個(gè)葉片，重復(fù)3次。葉片接種30d(天)后轉(zhuǎn)接1次，其間調(diào)查統(tǒng)計(jì)愈傷組織形成情況、芽發(fā)生情況；培養(yǎng)60d(天)后調(diào)查統(tǒng)計(jì)其愈傷組織分化情況、再生芽數(shù)。培養(yǎng)環(huán)境溫度25土2℃，光照強(qiáng)度2000～3000lx，日光照時(shí)間為12h(小時(shí))。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織及芽的生長(zhǎng)情況

經(jīng)過暗培養(yǎng)處理3d(天)后，光照下培養(yǎng)2周，在離體葉片的葉脈剪口處即形成大量的愈傷組織：一種是疏松的淡黃色愈傷組織，一種是白色的愈傷組織；同時(shí)在離體葉片上葉脈剪口處形成一種綠色半球形的突起:在光照下培養(yǎng)4周，疏松淡黃色的愈傷組織逐漸褐化死亡，白色愈傷組織上形成小的芽點(diǎn);而葉脈剪口處形成的半球形綠色突起則能分化出綠色小芽。在16種培養(yǎng)基中(見表1)，RUS-25離體葉片再生芽的優(yōu)化培養(yǎng)基為8號(hào)培養(yǎng)基，平均誘導(dǎo)頻率最高為87.5％。

2.2 暗培養(yǎng)對(duì)誘導(dǎo)離體葉片分化影響

表1表明，暗培養(yǎng)對(duì)誘導(dǎo)RUS-25離體葉片分化有影響，雖然直接在光照下培養(yǎng)即能形成愈傷組織并能進(jìn)行芽的分化，但分化率較低。暗處理3d(天)，再生芽頻率達(dá)到最大值，暗處理時(shí)間延長(zhǎng)，再生芽頻率反而降低。

2.3 不同激素對(duì)芽誘導(dǎo)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明(表1)，6-BA對(duì)誘導(dǎo)RUS-25離體葉片分化有較大影響，濃度過高或過低不利于愈傷組織的脫分化，在6-BA濃度為0.5mg／L的情況下，愈傷組織`的誘導(dǎo)率最高達(dá)100％；在6-BA較高濃度下(2.0mg/L)，有利于離體葉片芽的誘導(dǎo)。IBA、NAA對(duì)誘導(dǎo)離體葉片分化有較大影響，適宜的濃度為1.Omg/L+0.2mg/L，誘導(dǎo)效果較好，再生芽誘導(dǎo)率達(dá)到87.5％。GA3對(duì)RUS-25離體葉片分化影響較小，以不添加效果最好。

通過計(jì)算比較試驗(yàn)結(jié)果，確定誘導(dǎo)RUS-25離體葉片植株再生的最佳培養(yǎng)基配方為MS4-6-BA 2.Omg/L4-IBA 0.5mg/L+NAA 0．2mg/L。但該組合在本試驗(yàn)中未出現(xiàn)，后經(jīng)進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證，該培養(yǎng)基組合誘導(dǎo)分化效果良好，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到90．3％。

2.4 不同接種材料對(duì)離體葉片愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

外植體的葉齡顯著影響甜櫻桃矮化砧木RUS-25離體葉片愈傷組織的誘導(dǎo)(表2)，完全展開的老葉片及未展開的心葉愈傷組織誘導(dǎo)率較低，不定芽再生數(shù)量少；新展開的嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)率為100％，平均不定芽數(shù)為6.1個(gè)。

2.5 不定芽的繼代、生根及移栽

由葉片分化得到的不定芽轉(zhuǎn)接在繼代培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0mg/L+ZT O.3mg/L上進(jìn)行培養(yǎng)，每30d(天)轉(zhuǎn)接1次，多次繼代試管苗達(dá)到一定數(shù)量后，轉(zhuǎn)入MS+IBA0.5mg/L+活性炭0.3％生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)3周后，生根率達(dá)到93.6％；當(dāng)試管苗根均長(zhǎng)2Cm、有2～3條根時(shí)，打開瓶口煉苗7d(天)左右，移栽到滅菌細(xì)沙基質(zhì)中，成活率達(dá)90.0％以上。

3 結(jié)論與討論

1)櫻桃葉片的離體再生較困難，僅有個(gè)別品種能獲得再生植株，但誘導(dǎo)率較低。黃文江等用馬哈利離體葉片，誘導(dǎo)率為31.1％，劉慶忠等用吉塞拉離體葉片，誘導(dǎo)率為70.1％；本試驗(yàn)通過適宜的激素配比使甜櫻桃矮化砧木RUS-25離體葉片芽誘導(dǎo)率達(dá)到90.3％，以此可以推斷，離體葉片的再生能力除受外部條件的影響外，主要由基因型決定。

2)暗培養(yǎng)對(duì)離體葉片再生植株影響有差異，有的品種需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的暗培養(yǎng)才能誘導(dǎo)出再生植株，本試驗(yàn)結(jié)果表明，暗培養(yǎng)3d(天)即可誘導(dǎo)RUS-25離體葉片再生植株，時(shí)間延長(zhǎng)，效果反而差。

3)本試驗(yàn)中6-BA的濃度為2.0mg/L時(shí)，甜櫻桃矮化砧木RUS-25離體葉片誘導(dǎo)率最高，為試驗(yàn)設(shè)計(jì)的最高濃度，在繼續(xù)提高6-BA的濃度的情況下，是否仍能提高離體葉片誘導(dǎo)率有待于進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。