壓應力對增生性瘢痕成纖維細胞生長特性的影響

[摘要]目的：探討不同持續時間壓應力對人增生性瘢痕成纖維細胞生長特性的影響。方法：組織塊培養法獲取人增生性瘢痕成纖維細胞(HSFb)，并隨機將HSFb隨機分為對照組(未施壓)、持續施壓組(25mmHg，6～8天)和施壓(25mmHg，3～4天)后去除壓應力組。分別以MTT法測定細胞生長抑制率、流式細胞儀測定細胞生長周期、免疫組化觀察增殖細胞核抗原(PCNA)的表達及Annexin-V-PI標記法測定細胞凋亡情況。結果：25mmHg持續壓應力對HSFb的生長抑制率隨加壓時間的延長逐漸增大；與對照組相應時相點比較，PCNA表達降低，處于增殖期(S+G2+M)細胞比例減小；細胞凋亡率隨施壓時間延長逐漸增加；而施壓后去除壓應力繼續培養觀察顯示，HSFb的抑制率逐漸回降，PCNA表達增加和增殖期細胞比例“反彈”增大，細胞的凋亡率也逐漸下降。結論：適當的持續壓應力對人增生性瘢痕成纖維細胞具有抑制增殖與促進凋亡的共同效應，短期加壓后去除壓力致使上述效應“反彈性”降低，可能是臨床上對增生性瘢痕壓迫治療需要早期、持續、長期維持的原因之一。

[關鍵詞]機械壓力；增生性瘢痕；成纖維細胞；增殖；凋亡

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2007）11-1545-06

Effects of the Mechanical Stress on the characteristics of growth of human hypertrophic scar fibroblasts in vitro

XIAO Hong1，LI Jian-fu1，FU Xiao-bing2

(1.Department of Plastic and Reconstructive Surgery，Southwest Hospital，the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China; 2.Institute for Basic Research，Trauma Center of Postgraduate Medical College，General Hospital of PLA，Beijing 100853)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of mechanical stress on the growth characteristics of human hypertrophic scar fibroblasts(HSFb) in vitro.MethodsHuman hypertrophic scar fibroblasts obtained from the patient who suffered from hypertrophic scar in my hospital were isolated and cultured in vitro， and then they were randomly divided into 3 groups as follows：control group (no compression)，continuous compression group ( with 25 mmHg air pressure for 6-8 days ) and the cancelled stress after compressing group . The cellularproliferation was determined by MTT assay，cell cycle was detected on the flow cytometer，and PCNA expression in HSFb was confirmed by immunohistochemistry method. The apoptosis of scar fibroblasts was measured with Annexin V binding with PI labeling.ResultsBoth the inhibiting rate of HSFb growth and the apoptosis were markedly increase in continuous pressure group with loading time. Compared with control group，the PCNA expression and cell ratio within proliferative phase(S+G2+M) was decreased. However，the inhibiting ratio of HSFb growth，PCNA expression，cell ratio within proliferative phase and apoptosis ratio had gradually returned in the group of cancelled load after pressure.ConclusionBased on the above results，we suggested that combined effects of the proliferation inhibition and apoptosis promotion induced by continuous pressure in HSFb and the return of that combined effects after cancelling stress may potentially be one ofthe important reasons of well obtained therapeutic effect with pressure therapy for needing early stage and long time maintenance during the clinical practice.

Key words:mechanical stress;hypertrophic scar;fibroblasts;proliferation;apoptosis

增生性瘢痕(hypertrophic scars，HS)嚴重影響機體外觀和功能，其治療目前尚缺乏有效手段。臨床實踐證明，壓迫療法的療效與實施壓迫的早晚和持續時間呈明顯相關性，但其具體機制仍不是很確切[1]。越來越多的體外實驗證據表明，張應力通過降低細胞凋亡與促進成纖維細胞合成豐富的細胞外基質而加速HS的形成[2-3]，但壓應力則起到了相反的調控作用，從而抑制HS的生長[4-5]；我們前期研究也得到相似結果，為更深入探討壓應力對人增生性瘢痕成纖維細胞(hypertrophic scar fibroblasts，HSFb)生長特性的影響及其機制，本研究選擇25mmHg壓應力作用于HSFb，進行壓應力對其生長特性影響的實驗觀察。

1材料和方法

1.1 試劑與設備：DMEM培養基(Hyclone 公司)；HANK'S(Hyclone 公司)；PBS(邁新)；胎牛血清(Euroclone)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma公司)；二甲基亞砜(Amersco公司，美國)；胰蛋白酶(Sigma公司)；倒置相差顯微鏡(Olympus CK40)；酶聯免疫檢測儀(DG3022A型，華東電子管廠)；Annexin-V-PI試劑盒(JingMei)；PCNA試劑盒，DAB顯色劑(邁新公司)；細胞加壓裝置(自行改裝簡易氣控加壓細胞培養儀，專利申請已公示，見圖1)。

1.2 增生性瘢痕的來源：增生性瘢痕組織取自2006年2月本院燒傷科患者(女性，20歲，全身大面積熱燒傷愈合后3月，頸胸部形成大片瘢痕，取材部位為前胸壁，術后病理診斷為增生性瘢痕組織)手術后志愿捐贈。

1.3 方法

1.3.1 增生性瘢痕成纖維細胞的培養：采用組織塊培養法。取新鮮瘢痕組織，去除表皮和皮下組織，在少量胎牛血清(FCS)中剪碎，組織塊(0.5～3mm)接種于培養瓶，在體積分數為5%的CO2、37℃條件下培養4h，然后加入含體積分數為20%FCS的DMEM8ml，繼續培養，每3天換液1次，待原代培養細胞生長融合成片，以2.5g/L胰蛋白酶消化，傳代培養，取第4～8代細胞備用。

1.3.2 壓應力對增生性瘢痕成纖維細胞形態的影響：將HSFb以每孔1×105個細胞分別接種于兩塊6孔培養板，均置入常規CO2培養箱12h貼壁后，一塊以常規CO2培養箱培養細胞，一塊移入簡易氣控加壓細胞培養儀培養細胞，均培養4天后取出，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態。

1.3.3 壓應力對增生性瘢痕成纖維細胞增殖活性的影響將HSFb以每孔1×104個細胞接種于96孔培養板，每孔體積200μl。以常規CO2培養箱分別培養2、4、6、8天后檢測指標為對照組；細胞貼壁后移入簡易氣控加壓細胞培養儀，施加壓力大小為25mmHg，分別培養2、4、6、8天后檢測指標為持續加壓組；在上述壓力下培養4天后改常規CO2培養箱再培養2、4天后檢測指標為加壓后去加壓組。分別培養相應天數后，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔的吸光值(A)，檢測波長為490nm。計算細胞生長抑制率(IR)=(1-施壓組A值/對照組A值)×100%。

1.3.4 壓應力對增生性瘢痕成纖維細胞周期及增殖細胞核抗原(PCNA)表達的影響：分別將HSFb以每孔1×106、5×105個細胞接種于欲培養3天、6天的6孔培養板中。以常規CO2培養箱培養細胞，分別培養3天、6天后收集細胞或細胞爬片為對照組；12h貼壁后細胞移入簡易氣控加壓細胞培養儀，施加壓力大小為25mmHg，分別培養3天、6天后收集細胞或細胞爬片為持續加壓組；在上述壓力下培養3天后改常規CO2培養箱再培養3天后收集細胞或細胞爬片為加壓后去加壓組。

流式細胞儀測定細胞周期：分別收集上述細胞，調整其個數達1×106/ml。加冷PBS洗滌離心2次，70%冷乙醇4℃固定保存。PBS洗滌離心2次去除乙醇，加入PI染液(含PI 50μg/ml、Rnase 100μg/ml、Triton-X100 0.1%、檸檬酸鈉1mg/ml、0.9%NS)，4℃避光染30min，200目尼龍網過濾，上機作FCM檢測。采用488nm激發波長檢測細胞核中PI熒光強度，打印DNA含量分布組方圖，自動擬合細胞周期各時相比例。

免疫組化檢測細胞PCNA表達情況：將上述細胞爬片按試劑盒說明書應用SABC法，DAB顯色，蘇木精復染。結果采用三級計分法統計分析結果，并取平均值。判斷標準：根據染色強度，將結果分為3級，分別表示為淡黃色+、棕黃色++、棕褐色+++；根據陽性細胞數，計算每100個細胞中陽性細胞數，然后二者相乘，即為最后評分。理論上結果的范圍為0～300分。

1.3.5 壓應力對增生性瘢痕成纖維細胞凋亡的影響：分別將HSFb以每孔1×106、7×105、5×105、3×105個細胞接種于欲培養2天、4天、6天、8天的6孔培養板中。以常規CO2培養箱分別培養2、4、6、8天后收集細胞檢測指標為對照組；12h貼壁后細胞移入簡易氣控加壓細胞培養儀，施加壓力大小為25mmHg，分別培養2、4、6、8天為持續加壓組；在上述壓力下培養4天后改用常規CO2培養箱再培養2、4天檢測指標為加壓后去加壓組。分別培養相應天數后收集細胞，調整其個數達1×106/ml。離心后重新懸浮于1ML的Annexin-V-FITC染色液。室溫下染色5min，然后在細胞懸液中加入10μl的PI保存液，室溫下染色5min上流式細胞儀檢測。采用藍色激發光(波長為488nm的亞離子激光)，綠色熒光檢測范圍為530nm左右，紅色熒光檢測范圍：大于600nm，自動打印凋亡比例結果。

1.4 統計學處理：采用SPSS10.0統計軟件分析，數據以均數±標準差表示，采用方差分析，P值＜0.05為有統計學意義。

2結果

2.1 活體細胞倒置相差顯微鏡觀察：顯微鏡下觀察HSFb施加壓力組與對照組均呈長梭形，大部分細胞可見向外伸出2～3個長短不一的突起，細胞的走行比較紊亂，方向性較差，形態特征無明顯差別。培養相同的4天后，加壓組較對照組細胞密度降低，見圖2。

2.2 壓應力對增生性瘢痕成纖維細胞生物活性的影響：在對數生長期(2～6天)，壓應力對HSFb的生長抑制率隨持續時間的延長逐漸增大，非對數生長期(8天)抑制率無上述關系；施壓后去除壓應力組細胞抑制率較相應時相點持續壓力組細胞減小，并隨去壓力時間延長較持續加壓組減小幅度越大，見表1。

2.3 壓應力對增生性瘢痕成纖維細胞周期和增殖細胞核抗原(PCNA)的影響：持續加壓組(3、6天)處于增殖期(S+G2+M)細胞比例、PCNA染色光密度積分較相應時相點對照組(3、6天)均明顯減小，有顯著性差異(P<0.01)；施壓(3天)后去除壓應力(3天)，處于增殖期細胞比例、PCNA表達的光密度積分逐漸恢復，均明顯大于持續加壓組但小于未加壓對照組，有顯著性統計學差異(P<0.01)，見表2、3；圖3、4。

2.4 壓應力作用對增生性瘢痕成纖維細胞凋亡的影響：Annexin V聯合PI法檢測HSFb凋亡指數。在培養周期內，無論細胞是否處于對數生長期，隨著培養時間延長，未施壓的對照組細胞凋亡率無明顯變化；持續受壓組細胞隨施壓時間延長凋亡率逐漸增加；持續加壓組較對應時相點對照組細胞凋亡率明顯增加，有顯著性統計學差異(P<0.01)。受壓(4天)后去除壓應力細胞增高的凋亡率逐漸下降，明顯低于相應時相點持續加壓組，并隨去出壓力時間延長，凋亡率下降趨勢越明顯，有顯著性統計學差異(P<0.01)，見表4、圖5。

3討論

既往實驗證實機械應力作用于細胞可致細胞形態發生改變。Grymes等[6]將皮膚成纖維細胞作周期性牽拉，發現這種牽張力作用后原來雜亂排列的細胞沿著張力方向變得有序，并證實細胞感知應力并傳導應力信號的過程中，細胞內微絲起著重要作用。而Acevedo與Sumpio的實驗[7-8]結果顯示，牛的動脈內皮細胞在壓應力作用下，細胞數量不僅顯著增加，而且細胞形狀被拉長。但本實驗研究發現：壓應力作用人增生性瘢痕成纖維細胞后，除了細胞密度降低外，對細胞的形態并無明顯影響。是否是這種病理狀態下的細胞形態對壓應力敏感度減低，或其它原因尚待更深入研究。

臨床實踐證明，應用壓迫療法治療增生性瘢痕開始時間越早，治療效果越好[9]，并且壓迫時間達6個月以上，一般6～18個月，直到瘢痕成熟，變得白晰、柔軟和平坦[10]，甚至有部分研究認為持續時間越長效果越好，其機制何在，既往報道較少。Cheng等[11]觀察到，早期增生性瘢痕呈指數級增厚，1.5年后穩定，且在隨后的2年里逐漸變薄，故建議在瘢痕形成后持續使用壓應力治療18～24個月，至少12個月。Costa等[12]研究認為：壓應力是通過加速增生性瘢痕的成熟過程起作用。眾所周知，增生性瘢痕是皮膚創傷愈合所導致的良性組織異常增生，組織學上以成纖維細胞增殖并分泌大量的細胞外基質為主要特征，而成熟期瘢痕則成纖維細胞及其分泌的基質明顯減少。因此，從理論上，只要干預因素能阻止瘢痕成纖維細胞的增殖，降低其分泌細胞外基質的量，就會有療效。本實驗結果顯示：在細胞對數生長期(2～6天)，25mmHg持續壓應力對HSFb的抑制率隨持續時間的延長逐漸增大，在非對數生長期(8天)無此效應； 25mmHg持續壓應力導致HSFb核增殖抗原(PCNA)表達降低，處于增殖期(S+G2+M)細胞比例減小；施壓一段時間后去除壓應力，抑制率逐漸“反彈”，低于相應時相點的持續加壓組，PCNA表達和處于增殖期細胞比例也“反彈”增加，均超過相應時相點持續加壓組細胞。在細胞凋亡方面，于培養周期內，無論細胞是否處于對數生長期，未施壓的對照組細胞凋亡率很低，并且隨培養時間的延長凋亡率無明顯變化；持續加壓組細胞隨施壓時間延長凋亡率逐漸增加；加壓4天后去除壓應力的細胞，增高的凋亡率會逐漸“反彈”下降，明顯低于持續加壓組。結果提示，細胞處在對數生長期，壓力對增殖的抑制效應隨時間延長抑制效果越明顯，而非對數生長期無此關系；短期施壓后去處壓力，對細胞增殖的抑制效應會逐漸“反彈”減弱。在細胞凋亡方面，無論細胞是否處在對數生長期，壓力對凋亡的促進作用在一定時限內均逐漸增強；短期施壓后去處壓力，對凋亡的促進效應也會逐漸“反彈”減弱。 因此，可以認為：由于早期增生性瘢痕的增殖期細胞較中、晚期逐漸成熟的瘢痕比例高，壓應力不僅對細胞增殖產生較大抑制作用，還對細胞凋亡有一定程度的促進作用，二者的復合效應導致瘢痕內功能細胞成份的減少，從而降低了胞外基質的沉積，可能是瘢痕治療越早，防治效果越好的原因之一。增生性瘢痕后期處于增殖期細胞的比例相對減少，雖然壓應力對細胞增殖的抑制作用相對減弱，但長期壓應力使細胞的凋亡率持續在較高水平，因而也會對瘢痕產生抑制作用；而短期施壓后停止施壓，細胞的增殖率和凋亡率逐漸向相反方向“反彈”，從而導致短期壓迫治療容易失敗，故而臨床上壓迫療法治療瘢痕需要早期、持續而長期施壓。

然而，增生性瘢痕的構成不僅有大量增生性成纖維細胞，還有其大量分泌的基質。近年大量研究表明：應力對細胞基質的分泌產生巨大影響[13-14]，持續壓應力對細胞基質分泌的影響是否是壓應力治療瘢痕療效良好的原因有待進一步證實。另外，本文研究為體外環境，與擁有眾多影響瘢痕形成的細胞因子[15-17]的體環境尚存在較大差異，因此，壓應力對這兩種環境中瘢痕成纖維細胞的影響是否相吻合，尚待深入研究。

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[收稿日期]2007-08-11[修回日期]2007-11-09

編輯/張惠娟