人臍帶血間充質干細胞研究近況及其在脂肪組織工程中的應用

肖宏濤 綜述，劉 毅 審校

人臍帶血間充質干細胞(HUCBMSCs)是一種具有全能干細胞特點的細胞，是中胚層發育的早期細胞，其形態和生物學特點與骨髓源性間充質干細胞相似，具有多向分化潛能，可分化為成骨細胞、脂肪細胞、神經細胞等[1]。與骨髓相比，臍帶血有更充足的來源，對供者無任何不良影響，其間充質干細胞更為原始，分化能力更強。因此臍帶血間充質干細胞有可能替代骨髓間充質干細胞成為組織工程的重要種子細胞。臍帶血間充質干細胞現已成為繼骨髓間充質干細胞、脂肪間充質干細胞后又一受眾多學者關注的熱點，本文就臍帶血間充質干細胞的研究近況及其在脂肪組織工程中的應用做一綜述。

1臍帶血間充質干細胞的發現及其生物學特征

1.1 臍帶血間充質干細胞的發現：在臍帶血中是否存在間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs），研究初期有許多爭議。Erices等[2]于2000年首次報道了從臍帶血中分離培養出間充質樣細胞，但在培養的29份標本中只有7份表現為間充質樣細胞(Mesenehymal-like cells，MLC)，其免疫表型和功能特點與骨髓來源的MSCs極為類似，其余22份培養出的均為破骨樣細胞，同時發現早產兒臍血中間充質干細胞的含量要較足月兒豐富。

Mareschi等[3]與上述意見不同，他們檢測了35份骨髓和58份足月產臍血標本，以Percoll密度梯度離心分離單個核細胞，臍血的貼壁細胞很快衰退，表達CD45、CD14、CD31等造血及內皮細胞的標志，他們還檢測了通常由MSCs分泌的兩種細胞因子IL-6、IL-11和通常由單核-巨噬細胞分泌的TNFα、TGFβ的mRNA表達，結果顯示臍血的貼壁細胞表達IL-6、TNFα和TGFβ，不表達IL-11，進一步證明臍血中缺乏MSCs，由此他們得出結論臍血中貼壁的單個核細胞表現出造血細胞的形態特點而不是MSCs。Yu等[4]培養了中期妊娠(16～28周)的胎兒血和足月分娩的臍帶血，前者可以得到MSCs，而后者只得到異質性的貼壁細胞，表達CD45，表明屬于造血細胞。Karen Bieback等[5]則通過實驗證明了足月妊娠產婦臍帶血中MSCs的存在，而且探究了MSCs的分離與臍血采集量、保存時間、單個核細胞數以及是否發生凝血和溶血有關。Lee等[6]應用梯度離心法從臍帶血中分離到間充質干細(MSCs)，并對其性質進行了初步鑒定，再次證實臍帶血中存在MSCs。

隨著研究臍帶血間充質干細胞的學者越來越多，學者們的結論也逐漸趨于一致，臍帶血中的確存在MSCs，但臍帶血間充質干細胞所占的比例遠較骨髓低得多(0.05～2.8/1.0×10⁶臍帶血單個核細胞，2～5／1.0×10⁶骨髓單個核細胞)，臍帶血MSCs連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，而且保持正常的核型和端粒酶活性。細胞周期研究表明，85％以上的MSCs處于G0/G1期，用流式細胞儀分析MSCs的RNA和DNA含量發現，臍帶血MSCs有5％處于G0 期，而骨髓MSC有20％處于G0期。

1.2 臍帶血間充質干細胞的生物學特性：近年來，對臍帶血MSCs的研究已取得了重大進展，對其生物學特性也有了更深入的認識。一般認為在體外培養的臍帶血MSCs的形態與骨髓MSCs相似，呈長梭形或紡錘形，只是體積稍小一些。有人還把臍帶血來源的MSCs和骨髓來源的MSCs作了基因表達方面的對比，結論是：兩者的基因表達除了因來源不同而導致的差別外，基本上是一致的[7]。臍帶血MSCs另一個重要的生物學特性是其具有很強的增殖能力，Gang 等[8]將來源于人的新鮮臍血單個核細胞分離培養，發現傳至第二代時即可見大量均一的成纖維狀貼壁細胞（即MSCs），大約86％的細胞處于G0/G1期。另據有關學者[9]統計6.6×10⁵個臍帶血原代MSCs在體外擴增10代后可獲得9.9×10⁸個細胞，擴增約1 500倍。這都充分表明了這些臍帶血MSCs細胞確實具有很強的增殖潛能。

目前已有眾多學者對臍帶血MSCs表面抗原特性作了研究，證實臍帶血MSCs均穩定地表達與MSCs相關聯的CD13、CD29 、CD44 、CD90 、CD105 (SH2)及CD73 (SH3 、SH4)抗原（SH2、SH3和SH4為MSCs相關性抗原），但不表達與造血及內皮細胞有關的CD14、CD34、CD45、CD31表面抗原[6，10-13]，這與骨髓來源的MSCs表面抗原完全一致[9，14]。臍帶血MSCs所具有的多向分化潛能也是其重要的生物學特性之一。Lee等[15]用RT-PCR技術分析臍帶血間充質干細胞，發現其表達多向分化基因：SDF21，NeuroD，血管內皮生長因子受體(VEGF2R1)等。同時許多試驗[1，6，8]也驗證了臍帶血MSCs在不同的誘導條件下具有向成骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、骨骼肌細胞等分化的能力。

2人臍帶血的采集方法及臍帶血MSCs的分離、培養、純化及擴增

2.1人臍帶血的采集方法：臍帶血的采集方法目前常用的是臍靜脈穿刺法，選擇無各種產科并發癥的健康足月產婦，胎兒娩出后，在距胎兒5～7cm的臍帶處進行雙結扎，剪斷臍帶，消毒母側臍帶斷端，用已消毒的注射器或負壓采血袋（已用肝素抗凝，20U/ml）穿刺臍靜脈抽取50ml左右臍帶血液，4℃冰箱保存，不需要特殊處理，并于12h內進行分離。采集過程中必須嚴格無菌操作，避免按壓子宮或擠壓胎盤、臍帶，并且注意將抗凝液充分混勻[16]。取血時間也要控制在胎兒娩出后5min之內。

2.2 臍帶血間充質干細胞的分離：在分離臍帶血MSCs方面目前尚無統一的方法，根據不同的實驗條件可選用不同的方法。①密度梯度離心法：鑒于MSCs與其他細胞密度的差異，采用Pereoll或者Ficoll分離液來實現細胞間的分離。其中使用Pereol1分離液獲得的MSCs大小均勻，純度較應用Ficol1分離液獲得的細胞純度高，此方法簡單有效，成本低廉；②貼壁篩選法：依據MSCs易貼附在塑料培養物上生長的特性將其與非貼壁細胞分離；③流式細胞儀分離法：根據間充質干細胞大小不同或細胞表面的一些特殊標志，采用流式細胞儀對其進行分選，該方法可獲得較為純化的間充質干細胞，但是分離過程對細胞活性影響較大，且實驗條件要求較高，所需的標本量大，因此沒有廣泛的使用；④免疫磁珠分離法：原理是使用表面覆有特異性抗體的磁珠與間充質干細胞結合，再利用永久磁鐵將間充質干細胞吸引分離出來。免疫磁珠分離法可以分離出純度較高的細胞，但價格昂貴，難以推廣；⑤單細胞克隆的方法[17]分離MSCs，實驗條件要求高，所需標本量較大，不便于獲得大量MSCs。此外，遲作華等[18]還采用了羥乙基淀粉沉淀法分離MSCs，此法優點是能減少體外處理步驟，減少處理過程中對細胞的損傷等，當前應用該方法的人還不多。目前最常用的方法是密度梯度離心法和貼壁篩選法聯合應用[1]：先用密度梯度離心法從臍帶血中分離出單個核細胞，再依據MSCs易貼附在塑料培養物上生長的特性，用貼壁篩選法將其從造血系統細胞中分離出來，從而獲得純度較高的MSCs。此法操作相對簡單，可以避免僅使用密度梯度離心法分離出的細胞成分復雜的缺點，同時又可避免單用貼壁篩選法時標本中大量的紅細胞占據MSCs所需貼壁空間的不足，是一種很實用的方法。

2.3 臍帶血間充質干細胞的培養、純化及擴增：應用間充質干細胞專用培養基（MesencultTM）或DMEM培養基（調PH至偏酸性），加10%～20%的胎牛血清（FBS），置于37℃、5%CO₂孵箱內培養，在接種4～7天后出現貼壁的間充質樣細胞，開始為圓形或不規則形，逐漸伸出突起，最初散在分布，與大量的破骨樣細胞混雜存在。破骨樣細胞胞體較大，呈圓形，內含多個核。MSCs多為成纖維樣的長梭形細胞，少部分呈多角形，單個核，有較長的突起，折光性強。隨著在條件培養基的環境下培養，破骨樣細胞逐漸減少，兩周后MSCs在局部形成包含有幾十個到幾百個細胞的克隆，由于細胞的迅速增殖，3周后細胞生長可達80%～90%融合，每個克隆約包含幾百至幾千個細胞，此時的MSCs呈較均一的長梭形。一般傳代至第3代時即可獲得純度較高且形態均一的長梭形間充質干細胞。除上述常用的培養基外，還有含20%胎牛血清（FBS）+堿性成纖維生長因子(bFGF)+L-谷氨酰胺的IMDM培養基[6]及培養臍帶血MSCs的無血清培養基，該培養基的最大優點是可避免含血清培養的細胞可能存在動物攜帶的已知或未知病原體傳染人類的隱患[19]。

由于到目前為止還沒有十分完善的培養擴增臍帶血MSCs的方案，于是許多學者便紛紛著手于培養條件優化方面的研究。Shetty等[20]將含人臍帶血血清的DMEM/F12培養基與含胎牛血清的DMEM/F12培養基進行了對比，證實不同來源的MSCs在含人臍帶血血清的DMEM/F12培養基中培養有更大的增殖能力，在培養MSCs方面更高效。劉素芳[21]采用四種不同的培養基作了對照，分別是低糖DMEM (Dulbecco改良的Eagle培養基)組、高糖DMEM組、低糖DMEM+干細胞因子組、MesencultTM培養基（一種特殊成分的液體培養基，與其添加物配合使用可促進間充質干細胞分化為脂肪細胞）組，結果發現低糖DMEM +干細胞因子組和MesencultTM培養基組細胞生長旺盛，提示這兩種方法較好。但是由于干細胞因子用量較大，價格較貴，所以低糖DMEM +干細胞因子聯合應用干細胞因子的方法并不十分適用。MesencultTM培養基為酸性培養基，能促進臍帶血MSCs增殖，保持其未分化狀態，其酸性環境也有助于消除造血干細胞和破骨樣細胞[22]，因此，MesencultTM培養基是一種適合臍帶血間充質細胞生長的培養基。

總之，不同的培養基、不同批次的血清、不同的PH值、不同的種植密度都可能影響MSCs的生長。與骨髓MSC相比，目前臍血來源的MSCs仍存在數量少、頻度低等問題。據統計[9]約1/4的臍血樣單個核細胞培養后出現MSCs，3/4的臍血樣單個核細胞培養后出現破骨樣細胞，因此，在體外培養過程中，如何消除破骨樣細胞的存在，如何更好地對其進行純化擴增，以獲得穩定、均一的MSCs仍是今后需努力探索的方向。

3臍帶血間充質干細胞的識別

由于尚無特異性標記物，目前臍帶血MSCs的識別方法都是通過形態學及在培養過程中出現的分子表型，如：表達CD13、CD29、CD44、CD90、CD105、CD73，而不表達與造血及內皮細胞有關的表面抗原CD14、CD34、CD45、CD31，然后逆推得知是否為MSCs，還有體外培養時，給予不同的誘導條件，分離細胞出現分化表型，可分化為成骨細胞、脂肪細胞、神經細胞等，從而逆推其為MSCs[1]。還沒有直接的方法可鑒定得到的臍帶血MSCs。

4臍帶血MSCs成脂分化及調控脂肪細胞分化的信號轉導途徑（通路）

4.1 臍帶血MSCs成脂分化：脂肪細胞系是由起源于中胚層的多能干細胞逐步分化、發育而成，其過程大致為：多能干細胞（Multipotential stem cell）-脂肪母細胞(Adipoblast)-前脂肪細胞(Preadipocyte)-不成熟脂肪細胞(Immature adipose cel1)-成熟脂肪細胞(Adipocyte)[23]。臍帶血MSCs向脂肪細胞分化同樣要經歷這一過程。目前在體外誘導臍帶血MSCs成脂分化的方案基本統一：先將體外擴增培養的臍帶血MSCs置于孔板或培養皿中，當細胞貼壁生長達到80%融合時，加入脂肪誘導劑（地塞米松1μmol/L、10mg/mL胰島素、0.5 mmol/L1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤、100μmol/L吲哚美辛）后，置于37℃、5%CO₂孵箱內培養。一般誘導7天后，胞質內開始出現小脂滴，14天后胞質內形成高折光性脂滴脂肪細胞，誘導培養21天，脂滴逐漸增大可充滿整個細胞，油紅O染色示胞核成藍色，脂滴呈桔紅色，脂肪細胞平均占（88.0±4.6）%[9]。臍帶血MSCs在向脂肪細胞誘導分化的這一過程中，首先是MSCs在體外實驗性誘導劑（如上述誘導劑）、生物活性因子、寒冷、激素等因素刺激下逐漸分化為單能干細胞，即脂肪母細胞，它保持著干細胞增殖活躍的特性，然后再進一步分化為前脂肪細胞，前脂肪細胞在經歷細胞融合、接觸抑制和克隆擴增等步驟后繼續啟動向成熟脂肪細胞分化的過程，并在胰島素、地塞米松、l-甲基-3-異丁基黃嘌呤等誘導劑協同作用下最終分化為成熟的脂肪細胞。

4.2調控脂肪細胞分化的信號轉導途徑（通路）：多細胞生物的大多數細胞不與外界直接接觸，對外界的刺激需要細胞間復雜的信號傳遞系統來傳遞，細胞信號傳導途徑（通路）是信號傳遞系統重要組成部分。信號傳遞系統通過信號轉導途徑（通路）對細胞進行著多方面的調控，其中包括對細胞分化的調控：使基因有選擇地表達，使細胞不可逆地分化為特定功能的成熟細胞。

脂肪細胞的分化主要是通過四條信號轉導途徑（通路）來調控： ①胰島素樣生長因-1 (IGF-1)激活的酪氨酸激酶途徑；②糖皮質激素/前列環素(PGI2)途徑；③cAMP-蛋白激酶A(PKA)途徑；④脂肪酸激活受體(FAAR)途徑。由于各種細胞系所處的發育階段不同， 故轉導途徑的激活方式也有所不同[24]。研究表明， 前脂肪細胞有眾多的IGF受體(IGF-1R)，但胰島素受體很少。生長激素和高濃度的胰島素通過IGF-1R誘導前脂肪細胞分化，此作用能被生理濃度的IGF-1所代替，IGF-1誘導脂肪細胞分化的信號轉導途徑可能主要通過:IGF-1R→胰島素受體底物1(IRS-1)磷酸化→SHc接頭蛋白→生長因子結合蛋白(Grb2)→鳥苷二磷酸釋放因子(SOS)→Ras 蛋白→Raf-1蛋白激酶→脂肪細胞特異基因的轉錄[25]。除上述的信號轉導途徑（通路）外，促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)通路也是調控脂肪細胞分化的一條重要信號傳導通路，它對脂肪細胞分化的調控復雜多樣，且貫穿整個分化過程[26]。

5臍帶血MSCs在脂肪組織工程中的應用前景

組織工程是工程學和生物科學相結合的新興學科，主要研究組織和器官的組織相容性替代物來維持和改善組織及器官的形態和功能，它在整形外科有廣泛的應用前景。其基本原理是將體外擴增具有特定生物學功能的種子細胞與可降解生物材料結合形成細胞-材料復合物，體外培養一定時間后植入體內，種子細胞在體內或體外不斷增殖并分泌細胞外基質，生物材料被逐漸降解吸收，最終形成所需要的具有一定形態和功能的組織或器官，以修復病損和重建功能。其主要由種子細胞、生物材料、組織構建及臨床應用四個研究方面構成。

組織工程的種子細胞來源有多種，包括胚胎干細胞、自體細胞、成體干細胞等。尋求具有容易獲得、容易體外培養增殖、長期傳代不改變生物學特征、抗原性小、組織修復能力強等特性的理想的種子細胞是組織工程研究的核心問題之一，臍帶血MSCs具備上述條件，原因為：成體干細胞中的臍帶血MSCs不涉及自體細胞疾病狀態下或老年患者的細胞往往增殖能力下降及胚胎干細胞的倫理學問題，同時還有強大的自我更新能力及多向分化潛能。且臍帶血MSCs與骨髓MSCs相比還有以下優勢：干/祖細胞較骨髓中更原始，增殖分化能力更強；淋巴細胞的免疫功能不夠成熟，移植物抗宿主病(GVHD)發生率較低；不會有腫瘤細胞等[14]。此外，和骨髓相比，臍帶血還有來源豐富，采集簡便等優點。因此，臍帶血MSCs現已成為備受中外學者重視的種子細胞。

自體脂肪移植已有上百年的歷史，因其來源豐富，取材容易，操作簡單，填充后外形好，無排斥反應等優點，備受整形美容外科的重視，但由于移植后脂肪細胞的成活率較低而達不到理想的療效，脂肪組織工程的應用有望擺脫這一困境。臍帶血MSCs通過成脂誘導可分化為前脂肪細胞，且目前已有前脂肪細胞接種在PLGA支架、蠶絲支架[27]、HYAFF11（透明質酸衍生酯）海綿支架[28]、膠原海綿、降解性毛氈、水凝膠、氟羥甲睪酮單絲膨化的聚四氟乙烯復合材料的報道，這些支架為前脂肪細胞在立體環境中培養保證其正常的形態和功能提供了條件。前脂肪細胞可與具有良好生物相容性和可降解性的三維支架體外復合培養，在恰當的時機將這種組織化細胞-支架復合物移植到軟組織缺損部位，隨著支架的降解和前脂肪細胞的不斷分化，這種組織化細胞-支架復合物將成為新的具有功能的活體脂肪組織。這種策略形成的脂肪可作為軟組織缺損部位的填充材料，有望對小乳癥、顏面萎縮、凹陷畸形等整形美容外科常見疾病提供滿意的治療。

臍帶血MSCs為組織工程研究提供了良好的種子細胞，通過深入研究它的分化機制、建立體外三維立體培養條件及開發體內應用的新型生物材料，相信在不久的將來一定能構建出適合于臨床的組織工程脂肪。隨著研究不斷深入，臍帶血MSCs在脂肪組織工程中的應用必將產生巨大的經濟及社會效益。

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[收稿日期]2007-08-29[修回日期]2007-11-07

編輯/李陽利