生長因子緩釋微球的制備及其對內皮細胞的影響

[摘要]目的：制備堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管內皮細胞生長因子（VEGF） 可降解緩釋微球，考察其生物活性的保存情況及它們對內皮細胞的作用。方法：采用改良的乳化冷凝法交聯制備復合bFGF、VEGF 的明膠緩釋微球，將它們加入內皮細胞的培養液中，用細胞計數法、四甲基偶氮唑鹽微量反應比色法(MTT法)測定細胞增殖情況。結果：復合bFGF、VEGF的緩釋微球平均粒徑（11.32±3.64）μm;培養1天后各組細胞計數、吸光度(A)值差異均無顯著性;5天后兩種生長因子緩釋微球組細胞計數、吸光度(A)值明顯高于對照組;7天后兩種生長因子緩釋微球組值仍高于其它組。結論：復合bFGF、VEGF的緩釋微球制備工藝簡便，具有良好的緩釋活性能較長時間地持續釋放活性bFGF、VEGF，可明顯促進內皮細胞的增殖。

[關鍵詞]成纖維細胞生長因子;血管內皮生長因子；微球；明膠；緩釋系統；內皮細胞

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2007）11-1538-05

The preparation of growth factors-impregnated microsphere and its effect on endothelial cells

WANG Lu，GUO Shu-zhong，SUI Ji-qiang，MA Xian-jie，SONG Bao-qiang，YI Cheng-gang

(Institute of Plastic Surgery of People's Liberation Army，Xijing Hospitol，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveTo prepare the bFGF、 VEGF- impregnated microsphere and to investigate its bioactivity and its effect on endothelials.MethodsThe bFGF、 VEGF - impregnated microsphere was prepared by emulsified cold -condensation method and was added to the RPMI 1640 medium. The proliferation of cultured endothelials were measured by cell counting and MTT method.ResultsThe average diameter of microsphere was(11.32±3.64)μm; the in vitro cellular study showed no significant difference in the cell number and cell viability of 4 groups 1 day after plate culture. The cell number and cell viability in bFGF、VEGF - impregnated microsphere group were more than those in other groups 5 days after plate culture. 7days after plate culture，the cell number and cell viability in bFGF、 VEGF - impregnated microsphere group were still higher.ConclusionThe preparing method is simple and accurate ， the bFGF、 VEGF- impregnated microsphere can promote the proliferation of endothelials through a long period ofbFGF、 VEGF sustained - release.

Key words:fibroblast growth factors;vascular endothelial growth factors;microspheres;gelatin;sustained-release system; endothelial cells

組織移植是整形外科常用的治療手段之一， 用于各種組織缺損的修復，也可以作為組織填充的材料，改善患者的外貌和體形。移植組織需要在受區重新建立血運，而在重新建立血運之前處于缺血狀態，但組織的耐缺血時間是有限的，如果不能及時建立血液循環，將會導致移植組織缺血壞死。利用生長因子局部應用促進血運重建取得了一定的效果，但外源性生長因子半衰期短，一次給藥效果不甚理想。

采用微球系統控制生長因子局部釋放是解決上述問題的一種有效方法。近年來，利用緩釋系統延長生長因子局部作用時間促進血管新生，從而促進移植組織的血運重建是整形外科最活躍的研究領域之一。本實驗制備VEGF及bFGF的明膠緩釋微球并作用于內皮細胞，通過細胞計數法、細胞活力檢測法，檢測緩釋微球的緩釋活性及其對內皮細胞的增殖作用。 為臨床提供一種促進移植組織血運重建的新方法，并為組織工程的發展奠定一定的基礎。

1材料和方法

1.1 試劑與設備：bFGF、VEGF(珠海億勝生物制藥有限公司)、RPMA1640 復合培養液(美圍Gileco公司)、明膠(等電點50，相對分子量99 000， Sigma)、胰蛋白酶(美國Sigma公司)、噻唑藍(美國Sigma公司)、 美國Bio-RAD Model 550酶標分析儀、日本H600-1V型透射電鏡、美國FJ一2003型計數儀。自制bFGF-明膠微球、VEGF-明膠微球。人bFGF /VEGF定量ELLISA試劑盒(QuantiKineR， RDsystems)， 250g/L戊二醛，丙酮，異丙醇，無水乙醚，液體石蠟，氨基乙酸為國產分析純，Span-80(Sigma公司)為進口分析純，水為雙蒸水，JJ21型精確電子攪拌器儀， TGL216G高速離心機，GENESIS凍干機(Virtis公司)，BX241數碼顯微鏡(Olympus)。ECV304內皮細胞系購自第四軍醫大學細胞工程中心。

1.2方法

1.2.1 bFGF-明膠微球的制備：將含有10g/L Span-80的液體石蠟30ml置于三口瓶中預熱至55℃，快速攪拌下滴加入同樣溫度的明膠水溶液4ml，并調節攪拌速度至450r/min，繼續攪拌10 min；形成油包水乳劑后迅速改冰浴，攪拌10min，使其完成固化；加入250g/L戊二醛0.1ml，攪拌下預固化2h，而后4℃固化24h，用丙酮、異丙醇、乙醚洗滌，揮去乙醚，真空干燥，得到粉末狀淡黃色微球。用雙蒸水洗凈有機溶劑并凍干。將200μl的bFGF溶液滴加在20mg的凍干明膠微球上，在4℃保持24h以使bFGF完全融入微球。鈷-60照射滅菌封存。將生理鹽水浸泡過的明膠微球涂片置于光鏡下，觀察其外形及分散度，同時測量膨脹系數。電鏡下測量500個微球的直徑計算其平均粒徑。以算術平均徑為微球的平均粒徑，計算公式為：平均粒徑= n1 d1+n2 d2+……+nn dn/n1+n2+n3+……+nn，式中n1，n2……nn為粒子數，d1，d2……dn為粒徑。

1.2.2 VEGF- 明膠微球的制備（同1.2.1）

1.2.3 bFGF/VEGF 緩釋微球的體外釋藥實驗：根據人bFGF/VEGF ELISA試劑盒說明用酶聯免疫儀于490nm測定吸光度值(A值)繪制標準曲線.取微球樣品10mg，放入PBS(pH7.4)緩沖液中，完全溶解后定容至100ml，取10μl另加90μl共100μl測出A值。由此計算出微球的載藥率和包封率。載藥率=(投藥量-上清液中藥量)/微球重量×100%；包封率=(投藥量-上清液中藥量)/投藥量×100%。

動態透析法進行體外釋藥實驗，將制備的復合緩釋微球10mg混懸于PBS(pH7.4)100ml中，置于37℃水浴搖床(135r/min)分別于各時間點(1，2，3，4，5，6，7天)取上清液100μl，測量其濃度，繪制復合微球釋藥曲線。

1.4 內皮細胞的培養和實驗分組：將購買的內皮細胞ECV304細胞系培養至鋪滿瓶底后，用0.25％胰酶消化5min，用含10％胎牛血清的RPMI 1 640終止胰蛋白酶作用。吸管吹散細胞團塊以獲取單個內皮細胞。將懸浮細胞接種于25ml培養瓶，細胞密度為5×105/瓶，置37℃，5％CO2孵箱培養。待細胞融合成單層后再傳5代培養備用。實驗分為四組：A組培養液為含體積分數10％小牛血清+20ng／ml VEGF、bFGF緩釋微球劑的RPMI 1 640，B組培養液為含體積分數10％小牛血清+20ng／ml VEGF緩釋微球劑的RPMI1640，C組培養液為體積分數10%胎牛血清+20ng／ml bFGF緩釋微球劑的RPMI 1 640，D組培養液為體積分數10%胎牛血清+與A組等量的空白微球的RPMI 1 640(空白對照組)。

1.5 VEGF、bFGF緩釋微球對內皮細胞數量的影響：取第5代培養的內皮細胞，以1×107／L接種于24孔板，使細胞長同步后按實驗分組換成不同的培養液分別于培養1、3、5、7天收集細胞，每個時相點設3個重復測量孔，用血球計數板計數。實驗重復5 次。

1.6 VEGF、bFGF緩釋微球對內皮細胞活力的影響[四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)：取第5代培養的內皮細胞，以1×107／L密度接種到96孔板，每孔200μl，使細胞生長同步后按實驗分組換成不同的培養液。分別于培養1、3、5、7天按常規先后加入四甲基偶氮唑鹽(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)，每個時相點設4個重復測量孔，用酶標分析儀依次檢測每孔吸光度（A)值，檢測波長為490nm。實驗重復5 次。

1.7 統汁學分析：結果以x±s表示：采用SPASS 10.0軟件進行統計分析和處理，四組均數間的比較采用t檢驗，多組均數間的比較采用單向方差分析(One-wayANOVA)。以P<0．05為差異有顯著性意義。

2結果

2.1 bFGF-明膠微球、VEGF-明膠微球的表觀，膨脹系數及平均粒徑光鏡下及掃描電鏡觀察可見制備的復合bFGF、VEGF緩釋微球干粉球體分散度良好，呈圓球體， 徑粒較均勻。微球在生理鹽水中的膨脹系數為1.3(直徑)，呈球型，無粘連，無塌陷或萎縮現象。干燥狀態的微球表面有少量顆粒狀吸附物，但未見微孔和裂紋， 如圖（1～4）。在掃描電鏡下測得微球粒徑呈正態分布，大部分為10～28μm，占86.7%，平均粒徑為（11.32±3.64）μm。凍干粉劑為淡黃色疏松粉末。加雙蒸水后為淡黃色乳狀溶液。再分散性良好。

2.3 緩釋微球體外釋放度：根據測定的A值，計算出微球的平均載藥率為0.26%，包封率為90.6%，載藥微球的釋藥速度主要取決于藥物的擴散速度和載體材料的降解速度，明膠微球在pH＞7.0時完全降解約需2月。復合微球具有良好的緩釋性能，如圖所示，微球在釋藥初期速度較快，而后速度減緩平穩釋放，7天后累計釋放93%。

2.3VEGF、bFGF緩釋微球對內皮細胞數量的影響：各組計數結果見表1。培養1天 后，各組內皮細胞數差異均無顯著性(F檢驗，P>0.05)；3天時，各組內皮細胞數較，A組>B組>C組>D組，各組間差異均有顯著性差異(q檢驗，P<0.05)；培養5天后，緩釋微球A組細胞計數明顯高于對照組(q檢驗，P<0.05)；7天后，A組值仍比其他組高，組間差異與5天時相仿。

2.4 VEGF、bFGF緩釋微球對內皮細胞活力的影響：各組內皮細胞A 值的檢測結果見表-2，培養1天 后，各組A 值間差異無顯著性(F檢驗，P>0.05)；3天 時，各組A值比較， A組>B組>C組>D組，B組與C組間差異有顯著性(q檢驗，P<0.05)；培養5天 后，各組A 值依次為：A組>B組>C組>D組，緩釋微球組A 值明顯高于對照組(q檢驗，P<0.05)；7天后，各組A值間差異與5天時相仿。

3討論

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一類調節血管內皮細胞活性的多肽， 能選擇性地作用于EC，是EC的特異性有絲分裂原，促進其增殖、遷移進而導致新生血管形成。可以改變EC的某些基因表達、促使EC分泌組織因子、膠原酶等，從而改變內皮細胞的細胞外基質，有利于血管生成。

VEGF家族及其受體(FLT-1、KDR／FLK-1、FLT-4)被認為是血管生成和血管滲透性的基本調節因子。在腫瘤、缺血缺氧等情況下，VEGF及其受體呈現高表達；而VEGF不足時，會導致血管腔閉合、血管退化。

bFGF是目前已知最強的促細胞生成因子，在促血管生成、創傷愈合和組織損傷修復過程中作用巨大，同時也在胚胎發育以及腫瘤的形成過程中有重要的作用。bFGF有兩個主要功能，誘導內皮細胞萌芽、增殖，增加血管通透性。bFGF可通過誘導EC 等細胞， 使之表達組織重建所需的纖溶酶原激活劑、膠原酶及核蛋白水解酶。上述物質可降解新生血管起始緣的基底膜及周圍基質，為細胞遷移并侵入周圍組織掃清障礙。實驗證明bFGF誘導的EC產生尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑(u-PA)在血管新生的早期起中心作用。

組織創傷部位含有多種生長因子和不同生長因子的受體，當一種生長因子調節細胞進入適當周期后，加入其他生長因子或是多種生長因子合用于同一環節，可加強細胞分裂增殖能力。VEGF 和bFGF都是血小板相關生長因子，在創傷愈合過程中具有協同作用，在傷口血管再生早期，內皮細胞由bFGF誘導，后期毛細血管的生長和分化由VEGF調節。用兩者共同刺激體外培養的毛細血管內皮細胞，在同樣的條件下，其細胞數目要比單獨用任何一種時多2～8倍[1]。SeShezzi 等很早就發現bFGF能上調VEGF在內皮細胞中的表達，主要通過細胞的自分泌和旁分泌途徑[2]。已經知道通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK) 打開內皮細胞間的連接和使細胞增殖，是VEGF和bFGF信號的共同通路，P44/22 MAPK就是這條共同通路中的一個信號蛋白[3]。Tokuda 等進一步研究了bFGF 和VEGF 之間的協同機制，先前發現bFGF 激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK) P44/P42 提高VEGF 的釋放，最近他們又發現應激活化蛋白激酶(SAPK) 的磷酸化是bFGF增強VEGF 表達的重要酶， 且SAPK比P44/P42 MAPK更為重要[4]。早在1986 年Lawrence 就聯合應用TGF-β、PDGF和EGF3種蛋白治療阿霉素造成的難治性潰瘍，取得好的療效。而薛斌等聯合應用VEGF和bFGF蛋白注射大鼠缺血皮瓣皮下促進了缺血皮瓣的存活，皮瓣的成活面積/血管數目明顯高于兩種因子單獨應用，兩種因子聯合使用能明顯提高其促血管生成能力[5]。

由于生長因子穩定性差，生物膜透過性差， 局部作用半衰期短，如bFGF在體內的半衰期僅為3～10min，直接應用效果不佳，而緩釋微球載體作為新型藥物緩釋控釋系統之一，具有緩釋藥物、靶向輸送、在保證藥物治療作用的前提下減少給藥劑量，降低藥物毒性等優點[6]是解決辦法之一。明膠是天然高分子生物材料，組織相容性好，可被組織吸收；在未吸水前耐高溫，可高溫消毒；吸水膨脹軟化后，溶點不超過30℃，具有廉價易得、無抗原性、摩擦系數低、在體內可自然降解等優點，已廣泛用于多種藥物劑型中[7]。明膠是氨基酸與肽類交聯形成的直鏈聚合物，能進行多種表面修飾及反應，制備時可根據不同要求設計。而且明膠中含有RGD生物活性短肽有利于細胞表面粘附分子識別。

微球制備采用改良的乳化冷凝法，其機制是等電點為5.0 的酸性明膠在水中溶解后，分子伸展為纖維狀，在冷凍脫水的條件下卷曲，并由多個分子凝聚成球狀微粒，在固化劑(戊二醛) 的作用下，明膠分子呈穩定性良好的三維網狀結構，并與荷電性相反的堿性bFGF 通過離子間的相互作用形成較為穩定的PECs[8]，兩者間形成一定的親和力，bFGF 被明膠吸附并包裹于微球中，隨著明膠的降解，實現bFGF在體內的控制釋放。而且在凍干過程中，明膠還可以取代水而與多肽形成氫鍵來穩定多肽的天然構象，從而保護因子活性. 明膠微球為實體微粒，被包裹藥物釋放相對緩慢，足以達到緩釋的要求[9]。

實驗結果顯示復合bFGF、VEGF 緩釋微球對內皮細胞數量和活力影響：空白對照組的微球成分對內皮細胞數量和活力無影響，緩釋載體安全可靠。培養1天后各組細胞計數、吸光度(A)值差異無顯著性；5天后復合緩釋微球組細胞計數、吸光度(A)值明顯高于對照組；7天后復合緩釋微球組值仍高于其他組。結果表明使用bFGF、VEGF的最初24h內作用不明顯；培養初期緩釋微球組釋放的bFGF、VEGF數量較少，促細胞增殖作用較對照組差異性不大，培養5天后，緩釋微球組持續釋放具有生物活性的bFGF、VEGF，而且在他們的協同作用下促增殖作用最強；培養7天后，雖然緩釋微球組仍在釋放bFGF、VEGF，雖然速度已經減慢且此前緩釋出的部分bFGF、VEGF 生物活性遭到破壞，但其釋放出的生長因子仍有促增殖作用，兩種因子協同作用效果明顯。

由于多肽的不穩定性，研究中如何保證生長因子持續高效作用是研究的難點之一，應用微球系統控制緩釋多肽類藥物是目前較為簡單有效和安全的辦法。如何提高微球的載藥量，延長藥物的持續釋放時間及如何與其他組織工程支架復合修復重建組織損傷還需要進一步深入研究。此外多種生長因子聯合應用的選擇與應用的比例及時間策略也需要更加深入的探究。

[參考文獻]

[1]SaadehPB， Mehrara BJ， Steinbrech DS ， et al. Mechanisms of fibroblast growth factor-2 modulation of vascular endithelial growth factor expression by osteoblastic cell[J]. Endocrinology， 2000， 14:2075-2083.

[2]Seghezzi G， Patel S， Ren CJ， et al. Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) induces vascular expression in the endothelial cell of forming capillaries: an autocrine mechanism contributing to angiogenesis[J]. Cell Biol，1998， 141:1659-1673.

[3]Eriksson K， Magnusson P， Dixelius J， et al. Angiostatin and endostatin inhibit endothelial cell migration in response to FGF and VEGF without interfering with specific intracellular signal transduction pathways[J]. FEBS Lett， 2003，536:19-24.

[4]Tokuda H ， Hirade K， Wang X， etal . Involvement of SAPKPJNK in basic fibroblast growth factor2induced vascular endothelial growth factor release in osteoblasts[J]. Endocrinol， 2003，177:101-107.

[5]薛斌，賀光照，黃崇本. VEGF 和bFGF 聯合應用促進缺血皮瓣存活的研究[J]. 重慶醫學，2003，32:564-565.

[6]Nimni ME. Polypeptide growth factors:targeted delivery systems[J]. Bio Materials，1997，18 :1201-1225.

[7]Yamamoto M， Ikada Y， Tabata Y. Controlled release of growth factors based on biodegradation of gelatin hydrogel[J]. J Biomer Sci Polym Ed，2001，12 :77-88.

[8]Rita C ， Elisabetta E ， Maria O. Dextran cross- linked gelatin micro2 spheres as a drug delivery system[J]. European J Pharm and Biopharm， 1999，47:153.

[9]隋繼強，韓 巖，吳 紅，等. 人表皮生長因子與堿性成纖維細胞生長因子納米緩釋劑對成纖維細胞的影響[J]. 中國美容醫學，2006，15(12):1342-1345.

[收稿日期]2007-08-15[修回日期]2007-11-02

編輯/張惠娟