電化學ＤＮＡ傳感器在臨床檢驗中的應用

摘要：針對傳統DNA測定方法中存在的嚴重問題，提出了新型測定DNA的技術-電化學DNA傳感器測定法。本文就電化學DNA傳感器的工作原理和實用效果等，進行了論述。

關鍵詞：電化學DNA傳感器；電化學換能器；電位吸附法；雜交信息；基因診斷；靶基因；寡核苷酸

對DNA的研究是生命科學領域中極為重要的內容，在人體組織、血液、微生物、病毒等樣本中特定DNA序列的定量檢測有著十分重要的意義，尤其對疾病的早期準確診斷及治療舉足輕重。DNA分子是多聚脫氧核苷酸，由堿基、脫氧核糖和磷酸三部分組成。特定DNA的堿基序列與其互補鏈的雜交，是各種測定DNA技術的基礎。

在研究者們的努力下，各種新的DNA檢測技術不斷出現。聚合酶鏈反應（PCR）是目前應用最為廣泛的電化學測定DNA技術，它有很高的靈敏度，已被廣泛地用于基因缺失和點突變的檢測。大多數專家認為：實現快速、簡便、準確、價廉的DNA測定，最有希望的是利用電化學傳感器。

一、 電化學DNA生物傳感器的工作原理

DNA傳感器設計的依據是核酸雜交動力學，它的基本組成包括一個DNA探針和一個換能器，每一種屬生物體內都含有其獨特的核酸序列，因此設計檢測核酸的生物傳感器的關鍵是設計一段寡核苷酸序列探針。探針一般由若干個堿基的核苷酸組成，是一段單鏈核酸分子，其堿基序列與被測DNA片段的堿基序列互補，能夠專一與特定的靶序列進行雜交，雜交過程具有很高的特異度和敏感度。換能器的功能是將DNA探針與被測定DNA片段的雜交信息轉換為可測量信號，根據雜交前后測量信號的改變量，分析出被測DNA的量。

電化學DNA傳感器，采用的是電化學換能器。電化學DNA傳感器是根據固定在電極上的核苷酸與溶液中互補核酸雜交時，能引起電化學換能器的電壓、電流或電導等電信號變化的原理設計的，通對電信號變化的檢測可對樣本中DNA的結構和含量等信息加以測定。電化學DNA傳感器是目前研究者認為最有發展前景的一類DNA分析方法。

二、 DNA片段在固體電極上的固定化方法

電化學DNA傳感器一般先用鉑碳電極、石墨電極、碳糊電極、汞電極、金電極等固體電極作基礎電極，DNA探針片段要有效地與之結合，不脫落且保持活性，其結合量應滿足靈敏度的需要。所以探針的固定化是重要環節，決定著傳感器的性能。

1. 吸附結合法。DNA片段很容易在電極表面發生吸附。熱變性的單鏈核酸DNA(ssDNA)分子強烈地吸附于電極表面，質子化的DNA亦如此，而單鏈DNA分子發生電還原反應后的還原產物的吸附能力為最強。

2. 共價鍵結合法。該固定化方法首先要在電極表面修飾上一些活性官能團，如氨基，羧基等。這些活性官能團與ssDNA產生共價鍵，由此將DNA片段修飾在電極表面。Liu等采用共價鍵法在石墨電極上固定了DNA探針，先將石墨電極拋光，經過1:1HNO3、丙酮洗滌、再用蒸餾水在超聲振蕩下清洗后，將石墨電極置于K2Cr2O7與HNO3溶液中，在20mA電流下氧化10s，然后把電極放入氫化鋰鋁的乙醚溶液中1h，以使電極表面產生羥基。用乙醚沖洗電極后，將電極浸入3%的3-氨基丙基三氧基硅烷的甲苯溶液中24h，最后用甲苯沖洗電極。經以上步驟處理后，電極表面導入氨基。在修飾了氨基的電極表面上滴加50ul含有0.1mol/L DEC(乙基-3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和0.1g /L ssDNA的0.1mol/L咪唑緩沖液(Ph 6.0)，在35℃下，恒溫3h， ssDNA便修飾在電極表面上，清洗電極以除去未共價固定化的ssDNA后，用紅外燈烘干，保存于TE緩沖液。

三、 雜交指示劑

DNA傳感器對目標基因的選擇性識別是靠核酸的雜交來完成的。為了檢測所發生的雜交信息，必須采用一種電活性物質來指示，這種電活性物質被稱為雜交指示劑。它能選擇性地與dsDNA結合，且仍然能保持其電活性，在電極上發生氧化還原反應，產生可測量信號。就雜交指示劑的作用方式而言，可分為嵌入劑、電活性標記物等。

1. 嵌入式雜交指示劑。嵌入式雜交指示劑與DNA分子的作用，一是通過指示劑分子嵌入雙鏈DNA雙螺旋的堿基之間，二是通過指示劑分子與DNA骨架上的磷酸基之間的靜電作用。比較有代表性的嵌入式雜交指示劑是蒽環抗生素類化合物，如道諾霉素、多柔比星、諾加霉素等。它們的共同結構特征是含有3個共平面的六元環所構成的四氫并四苯醌發色團。此外，也有染料、金屬離子絡合物等作為嵌入式雜交指示劑。

2. 電活性物質標記雜交指示劑。將電活性物質(如二茂鐵、蒽醌、聚吡咯、聚噻吩等)標記在DNA探針上。當探針與靶基因發生雜交時，電流強度會發生改變。Bauerle等研究了堿基與聚噻吩的結合，首先觀察單個堿基的作用，之后試驗了15個堿基DNA與聚噻吩的作用情況，認為其作為雜交指示劑前景是樂觀的。

四、 電化學DNA傳感器在臨床診斷中的應用

1. 細菌及病毒感染類疾病診斷。在傳統方法中，細菌感染是通過體外血液培養來診斷的，這需要幾日甚至幾十日的時間，嚴重延誤了疾病治療，利用DNA傳感器可快速檢測細菌和病毒。

Wang等利用計時電位的測定方法，在碳糊電極上固定了兩個長度分別為27和36堿基的DNA探針，此DNA探針與結核桿菌MTB的DR區DNA互補，可利用其雜交反應檢測MTB含量，選擇雜交指示劑CO(phen)。

2. 基因診斷。Wang等報道了艾滋病人類免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-I)相關的短DNA序列測定的傳感器。它們將21個和24個堿基與HIV-IU5LTR序列互補的單鏈寡核苷酸部分修飾在碳糊電極(CPE)上，以雜交指示劑(Cophen)的計時溶出峰來檢測雜交，靶基因片段檢出限為4×10-9mol/L。Wang等又提出了以肽核酸(PNA)代替ssDNA作為探針修飾到電極表面，已證明PAN與互補和苷酸有很多雜交特性，在許多方面顯示出優于ssDNA的性能，有望很好地用于基因診斷。

五、 展望

電化學DNA生物傳感器作為一類新的傳感器正在快速的發展，由于它在醫學、臨床診斷等領域中有著廣泛的應用前景，倍受研究者的關注。但是，這種傳感器尚存在易受干擾、重現性差等問題，仍限于實驗室階段。今后的研究目標主要是向使用化、小型化發展，并且在DNA固定化、信號轉換等方面不斷應用新技術，對傳感器的性能進行改善和補充，使之更加適應實際應用的需要。

參考文獻 ：

[1] Jacobs K， Wo1f S F， HainesL，et a1.Nucleic Acids Res，1987.

[2] Millan K M，Saraullo A，Mikkelsen S.Anal Chem，1994.

[3] 劉盛輝，孫長林，何品剛.方禹之.分析化學，1999.

[4] 龐代文，齊義鵬，王宗禮等.化學通報[J]，l994.

[5] 方禹之，劉盛輝，何品剛.高等學校化學學報，1996.