電化學(xué)ＤＮＡ傳感器在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用

摘要：針對(duì)傳統(tǒng)DNA測(cè)定方法中存在的嚴(yán)重問(wèn)題，提出了新型測(cè)定DNA的技術(shù)-電化學(xué)DNA傳感器測(cè)定法。本文就電化學(xué)DNA傳感器的工作原理和實(shí)用效果等，進(jìn)行了論述。

關(guān)鍵詞：電化學(xué)DNA傳感器；電化學(xué)換能器；電位吸附法；雜交信息；基因診斷；靶基因；寡核苷酸

對(duì)DNA的研究是生命科學(xué)領(lǐng)域中極為重要的內(nèi)容，在人體組織、血液、微生物、病毒等樣本中特定DNA序列的定量檢測(cè)有著十分重要的意義，尤其對(duì)疾病的早期準(zhǔn)確診斷及治療舉足輕重。DNA分子是多聚脫氧核苷酸，由堿基、脫氧核糖和磷酸三部分組成。特定DNA的堿基序列與其互補(bǔ)鏈的雜交，是各種測(cè)定DNA技術(shù)的基礎(chǔ)。

在研究者們的努力下，各種新的DNA檢測(cè)技術(shù)不斷出現(xiàn)。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是目前應(yīng)用最為廣泛的電化學(xué)測(cè)定DNA技術(shù)，它有很高的靈敏度，已被廣泛地用于基因缺失和點(diǎn)突變的檢測(cè)。大多數(shù)專(zhuān)家認(rèn)為：實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、價(jià)廉的DNA測(cè)定，最有希望的是利用電化學(xué)傳感器。

一、 電化學(xué)DNA生物傳感器的工作原理

DNA傳感器設(shè)計(jì)的依據(jù)是核酸雜交動(dòng)力學(xué)，它的基本組成包括一個(gè)DNA探針和一個(gè)換能器，每一種屬生物體內(nèi)都含有其獨(dú)特的核酸序列，因此設(shè)計(jì)檢測(cè)核酸的生物傳感器的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)一段寡核苷酸序列探針。探針一般由若干個(gè)堿基的核苷酸組成，是一段單鏈核酸分子，其堿基序列與被測(cè)DNA片段的堿基序列互補(bǔ)，能夠?qū)Ｒ慌c特定的靶序列進(jìn)行雜交，雜交過(guò)程具有很高的特異度和敏感度。換能器的功能是將DNA探針與被測(cè)定DNA片段的雜交信息轉(zhuǎn)換為可測(cè)量信號(hào)，根據(jù)雜交前后測(cè)量信號(hào)的改變量，分析出被測(cè)DNA的量。

電化學(xué)DNA傳感器，采用的是電化學(xué)換能器。電化學(xué)DNA傳感器是根據(jù)固定在電極上的核苷酸與溶液中互補(bǔ)核酸雜交時(shí)，能引起電化學(xué)換能器的電壓、電流或電導(dǎo)等電信號(hào)變化的原理設(shè)計(jì)的，通對(duì)電信號(hào)變化的檢測(cè)可對(duì)樣本中DNA的結(jié)構(gòu)和含量等信息加以測(cè)定。電化學(xué)DNA傳感器是目前研究者認(rèn)為最有發(fā)展前景的一類(lèi)DNA分析方法。

二、 DNA片段在固體電極上的固定化方法

電化學(xué)DNA傳感器一般先用鉑碳電極、石墨電極、碳糊電極、汞電極、金電極等固體電極作基礎(chǔ)電極，DNA探針片段要有效地與之結(jié)合，不脫落且保持活性，其結(jié)合量應(yīng)滿(mǎn)足靈敏度的需要。所以探針的固定化是重要環(huán)節(jié)，決定著傳感器的性能。

1. 吸附結(jié)合法。DNA片段很容易在電極表面發(fā)生吸附。熱變性的單鏈核酸DNA(ssDNA)分子強(qiáng)烈地吸附于電極表面，質(zhì)子化的DNA亦如此，而單鏈DNA分子發(fā)生電還原反應(yīng)后的還原產(chǎn)物的吸附能力為最強(qiáng)。

2. 共價(jià)鍵結(jié)合法。該固定化方法首先要在電極表面修飾上一些活性官能團(tuán)，如氨基，羧基等。這些活性官能團(tuán)與ssDNA產(chǎn)生共價(jià)鍵，由此將DNA片段修飾在電極表面。Liu等采用共價(jià)鍵法在石墨電極上固定了DNA探針，先將石墨電極拋光，經(jīng)過(guò)1:1HNO3、丙酮洗滌、再用蒸餾水在超聲振蕩下清洗后，將石墨電極置于K2Cr2O7與HNO3溶液中，在20mA電流下氧化10s，然后把電極放入氫化鋰鋁的乙醚溶液中1h，以使電極表面產(chǎn)生羥基。用乙醚沖洗電極后，將電極浸入3%的3-氨基丙基三氧基硅烷的甲苯溶液中24h，最后用甲苯?jīng)_洗電極。經(jīng)以上步驟處理后，電極表面導(dǎo)入氨基。在修飾了氨基的電極表面上滴加50ul含有0.1mol/L DEC(乙基-3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和0.1g /L ssDNA的0.1mol/L咪唑緩沖液(Ph 6.0)，在35℃下，恒溫3h， ssDNA便修飾在電極表面上，清洗電極以除去未共價(jià)固定化的ssDNA后，用紅外燈烘干，保存于TE緩沖液。

三、 雜交指示劑

DNA傳感器對(duì)目標(biāo)基因的選擇性識(shí)別是靠核酸的雜交來(lái)完成的。為了檢測(cè)所發(fā)生的雜交信息，必須采用一種電活性物質(zhì)來(lái)指示，這種電活性物質(zhì)被稱(chēng)為雜交指示劑。它能選擇性地與dsDNA結(jié)合，且仍然能保持其電活性，在電極上發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生可測(cè)量信號(hào)。就雜交指示劑的作用方式而言，可分為嵌入劑、電活性標(biāo)記物等。

1. 嵌入式雜交指示劑。嵌入式雜交指示劑與DNA分子的作用，一是通過(guò)指示劑分子嵌入雙鏈DNA雙螺旋的堿基之間，二是通過(guò)指示劑分子與DNA骨架上的磷酸基之間的靜電作用。比較有代表性的嵌入式雜交指示劑是蒽環(huán)抗生素類(lèi)化合物，如道諾霉素、多柔比星、諾加霉素等。它們的共同結(jié)構(gòu)特征是含有3個(gè)共平面的六元環(huán)所構(gòu)成的四氫并四苯醌發(fā)色團(tuán)。此外，也有染料、金屬離子絡(luò)合物等作為嵌入式雜交指示劑。

2. 電活性物質(zhì)標(biāo)記雜交指示劑。將電活性物質(zhì)(如二茂鐵、蒽醌、聚吡咯、聚噻吩等)標(biāo)記在DNA探針上。當(dāng)探針與靶基因發(fā)生雜交時(shí)，電流強(qiáng)度會(huì)發(fā)生改變。Bauerle等研究了堿基與聚噻吩的結(jié)合，首先觀察單個(gè)堿基的作用，之后試驗(yàn)了15個(gè)堿基DNA與聚噻吩的作用情況，認(rèn)為其作為雜交指示劑前景是樂(lè)觀的。

四、 電化學(xué)DNA傳感器在臨床診斷中的應(yīng)用

1. 細(xì)菌及病毒感染類(lèi)疾病診斷。在傳統(tǒng)方法中，細(xì)菌感染是通過(guò)體外血液培養(yǎng)來(lái)診斷的，這需要幾日甚至幾十日的時(shí)間，嚴(yán)重延誤了疾病治療，利用DNA傳感器可快速檢測(cè)細(xì)菌和病毒。

Wang等利用計(jì)時(shí)電位的測(cè)定方法，在碳糊電極上固定了兩個(gè)長(zhǎng)度分別為27和36堿基的DNA探針，此DNA探針與結(jié)核桿菌MTB的DR區(qū)DNA互補(bǔ)，可利用其雜交反應(yīng)檢測(cè)MTB含量，選擇雜交指示劑CO(phen)。

2. 基因診斷。Wang等報(bào)道了艾滋病人類(lèi)免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-I)相關(guān)的短DNA序列測(cè)定的傳感器。它們將21個(gè)和24個(gè)堿基與HIV-IU5LTR序列互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸部分修飾在碳糊電極(CPE)上，以雜交指示劑(Cophen)的計(jì)時(shí)溶出峰來(lái)檢測(cè)雜交，靶基因片段檢出限為4×10-9mol/L。Wang等又提出了以肽核酸(PNA)代替ssDNA作為探針修飾到電極表面，已證明PAN與互補(bǔ)和苷酸有很多雜交特性，在許多方面顯示出優(yōu)于ssDNA的性能，有望很好地用于基因診斷。

五、 展望

電化學(xué)DNA生物傳感器作為一類(lèi)新的傳感器正在快速的發(fā)展，由于它在醫(yī)學(xué)、臨床診斷等領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用前景，倍受研究者的關(guān)注。但是，這種傳感器尚存在易受干擾、重現(xiàn)性差等問(wèn)題，仍限于實(shí)驗(yàn)室階段。今后的研究目標(biāo)主要是向使用化、小型化發(fā)展，并且在DNA固定化、信號(hào)轉(zhuǎn)換等方面不斷應(yīng)用新技術(shù)，對(duì)傳感器的性能進(jìn)行改善和補(bǔ)充，使之更加適應(yīng)實(shí)際應(yīng)用的需要。

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