通心絡膠囊對全腦－局灶腦血大鼠的腦缺血耐受及腦源性神經營養因子的影響

摘要：目的 采用全腦一局灶腦缺血耐受大鼠模型，觀察通心絡膠囊對腦缺血耐受作用的影響。方法 線栓法制備大鼠全腦缺血－局灶腦放血再灌注模型(PC－MCAO)及局灶腦缺血再灌注模型(MCAO)。在不同缺血時間點觀察通心絡組、PC－MCAO組及MCAO組大鼠神經行為評分，用免疫組化法檢測腦源性神經營養因子(BDNF)陽性細胞數。結果 神經行為評分在通心絡組、PC－MCAO組和MCAO組的2h組之間無統計學意義(P>0.05)，通心絡24h，3d，5d組均顯著低于對應時程的PC－MCAO組和MCAO組(P<0.05)；各組缺血半暗帶BDNF陽性細胞數均增高，但通心絡組的陽性細胞數顯著高于對應時程的PC－MCAO組和MCAO組(P<0.05)。結論 通心絡膠囊能提高大鼠局灶腦缺血半暗帶BDNF的表達水平，促進神經元的修復，誘導腦缺血耐受。

關鍵詞：通心絡膠囊；腦源性神經營養因子；缺血預處理

中圖分類號：R743.3 R285.6 文獻標識碼：A 文章編號：1672－1349(2007)10－0961－03

有短暫性腦缺血發作(TIA)史者腦卒中的發病風險更高，因此，預防TIA病人腦卒中復發十分重要。新近的研究結果顯示，通心絡膠囊不僅可以治療急性缺血性腦卒中，也可用于TIA病人的二級預防。本研究旨在觀察通心絡膠囊對全腦缺血后再次局灶腦缺血再灌注大鼠的腦源性神經營養因子(BDNF)的影響，探討BDNF與腦缺血耐受的關系及通心絡膠囊的干預作用，研究通心絡膠囊在二級預防中的神經保護作用及其機制。

1 材料與方法

1．1 藥物與試劑 通心絡膠囊，河北以嶺藥業股份有限公司生產，主要由人參、水蛭、全蝎、土鱉蟲、蜈蚣、蟬蛻、赤芍、冰片等組成。兔抗大鼠BDNF單克隆抗體為北京中山生物技術有限公司生產。免疫組化試劑盒由北京中山生物技術有限公司提供。水合氯醛、肝素鈉、4％多聚甲醛均由四川大學華西醫學中心基礎醫學院臨床藥理前基地動物實驗室提供。

1．2 實驗動物與分組 130只清潔級健康成年SD雄性大鼠，體重(240～270)g，四川大學華西醫學中心實驗動物中心提供。實驗前在室溫下(20℃～25℃)保持晝/夜各12 h，環境適應性喂養1周，給普通飼料和自由飲水。隨機分為4組，即假手術組(10只)，大腦中動脈再灌注(MCAO)組(40只)，全腦缺血(PC－MCAO)組40只，通心絡組40只，即全腦缺血3 min后給予通心絡灌胃5d，1g/kg用蒸餾水配至1 mL，每日1次。所有大鼠在全腦缺血后當天開始灌胃。MCAO組在再灌注2h，24h，3d，5d后取材，PC－MCAO組及通心絡膠囊組分別在第2次再灌注2h，24h，3d，5d后取材。假手術組在實驗開始5d后取材。

1．3 大鼠全腦－局灶缺血模型

1．3．1 全腦缺血模型 采用Simon等制作全腦缺血模型的方法：用10％水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠四肢和頭部固定于手術臺上，頸部備皮，常規消毒鋪洞巾。行頸部正中切口，逐層分離暴露雙側頸總動脈。微動脈夾夾閉雙側頸總動脈3 min，觀察大鼠瞳孔散大，翻正反射消失，即產生全腦缺血。術后提尾無前肢內收屈曲，爬行時無追尾，否則應剔除。

1．3．2 MCAO模型 采用改良的Zealonga線拴法。單沙尼龍線，直徑0.285mm，加熱將一端烤制光滑呈圓球形，直徑(0.25～0.28)mm，紫外線照射消毒備用。用10％水合氯醛350mg/k8腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠四肢和頭部固定于手術臺上，頸部備皮，常規消毒鋪洞巾。行頸部正中切口，逐層分離暴露左側頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)，避免刺激迷走神經。經CCA切口插入尼龍線進入ICA約(18～20)mm至大腦中動脈近端，阻斷大腦中動脈血供2h后抽出尼龍線。術后提尾右前肢內收屈曲，爬行時追尾現象為成功標志。術中用烤燈維持環境溫度(37.0～37.5)℃。所有大鼠只栓塞左側大腦中動脈。

1．4 神經行為學評分 MCAO后24 h采用Zealonga評分法。0分：無神經功能缺失癥狀，活動正常者；1分：不能完全伸展對側前爪者；2分：爬行時出現向右轉圈者；3分：行走時，身體向偏癱側傾倒者；4分：不能自發行走，意識喪失者；5分：死亡。評分為0分和4分以上剔除，隨機補充保證每組10只。

1．5 腦組織切片制備及BDNF免疫組化染色 各組大鼠在規定的時間用10％水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉。開胸，經左心室灌注37℃的肝素鈉生理鹽水100 mL沖凈血液，再灌注40℃4％多聚甲醛200 mL。開顱取腦，置于4％多聚甲醛中保存(24～48)h。取視交叉前后2 mm的左側大腦組織，固定，脫水，石蠟包埋，連續切片，片厚4 μm，制成免疫組化片，60℃烤片2 h備用。免疫組化染色采用鏈親和素－生物素－過氧化物酶法。按試劑盒說明書提供的方法進行染色。BDNF陽性染色為細胞膜和細胞漿呈棕色。隨機選取10×40視野10個，分別測定每個視野的陽性染色細胞數，取其平均值。

1．6 統計學處理 數據以均數±標準差(x±s)表示。用SPSS10.0版軟件做t檢驗。

2 結 果

2．1 神經行為學評分 MCAO后2h，通心絡組的神經功能評分與PC－MCAO組、MCAO組無統計學意義(P＞0.05)。通心絡組24h，3d，5d的神經功能評分均低于對應時間的PC-MCAO組和MCAO組(P＜0.05)。通心絡組神經行為學評分從第5天開始下降。詳見表1。

2．2 BDNF免疫組化染色 全腦－局灶腦缺血再灌注2h，24h，3d，5d后各組均可見BDNF陽性細胞，通心絡組再灌注2h，24h，3d，5d BDNF陽性細胞數逐漸增多，PC－MCAO再灌注組2h，24h，3d BDNF陽性細胞數逐漸增高，5d時開始下降，MCAO組2h，24h組BDNF陽性細胞數逐漸增高，但從3d時就開始下降。通心絡組2h，24h，3d，5d BDNF陽性細胞數分別高于PC-MCAO組和MCAO組的對應時程組(P＜0.05)。詳見表2。

3 討 論

神經營養因子家族是一組由神經元支配的靶細胞分泌的小分子多肽，它們與神經元的存活和神經系統的生長密切相關，對視網膜神經節細胞、運動神經元、膽堿能神經元、多巴胺能神經元的存活和生長具有支持和促進作用。研究發現缺血后立即側腦室灌注BDNF，腦梗死總體積可以減小33％，皮層梗死體積減小37％。實驗研究結果表明，在腦缺血時BDNF的表達上調，在腦缺血中具有保護半影區神經元、抵抗損傷、促進損傷神經元修復、抑制遲發性神經元壞死、減小梗死體積的作用。主要是通過下面的機制：①抑制凋亡，腦缺血急性期細胞凋亡主要位于缺血半暗帶，遲發性神經元死亡主要也是細胞凋亡。研究發現，BDNF是調節Bel－2相關基因表達的上游信號，通過增加Bcl－2表達抑制細胞凋亡，在體內和體外均有神經保護作用；BDNF還能通過阻止Caspase－3的活性而抑制細胞凋亡。②影響神經細胞的分化和生存，維持神經元的存活，修復受損神經元。③拮抗興奮性氨基酸，減輕毒性損傷。急性腦缺血時，谷氨酸濃度增高使大量Ca²⁺進入細胞內，破壞細胞內外的離子平穩，導致缺血中心壞死和半暗帶神經元的遲發性死亡。BDNF能夠誘導鈣結合蛋白的表達，抑制Ca²⁺內流，穩定細胞內Ca²⁺濃度。④BDNF增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化酶等的含量，抑制腦缺血后一氧化氮合酶的表達、膠質細胞的活性和吞噬細胞的浸潤，減少自由基的生成，減輕自由基損傷。腦缺血后蛋白激酶C(PKC)快速失活，BDNF增強PKC的活性而實現腦缺血神經保護。BDNF還能促進內皮細胞的分裂與分化，刺激神經血管的生成，促進神經功能的恢復。通過以上機制BDNF減輕腦缺血時半暗帶神經元損傷，誘導腦缺血時產生缺血耐受性。

研究發現，腦缺血后產生的痰瘀熱毒害絡損髓是抑制神經干細胞(NSC)增殖分化的關鍵性病理因素，而解毒通絡是治療的重要方法。通心絡膠囊能改善血管內皮細胞功能，保護和促進修復內皮細胞；降低膽固醇和低密度脂蛋白水平；抑制血小板聚集和釋放；抑制血管平滑肌細胞增殖；降低血液黏度和纖維蛋白濃度；增加血管內皮細胞NO含量；降低血漿內皮素水平；具有益氣化瘀、解毒通絡、搜風解痙之功效，從而祛除了抑制神經，細胞增殖分化的病理因素，促進腦缺血后神經細胞的增殖和分化。本研究采用全腦－局灶腦缺血模型，模擬臨床中丁IA病人再發腦梗死的腦部病變。結果顯示，BDNF在腦缺血半暗區的皮質和皮層下的神經細胞中表達，通心絡組第2次再灌注后BDNF的表達隨時間逐漸增高，說明通心絡能夠誘導BDNF，產生腦保護作用。Kitagawa等發現了腦缺血耐受現象，指出腦缺血耐受是由于缺血預處理增加神經元對致死性腦缺血的耐受并減輕致死性腦缺血所造成的損傷。在本研究中PC－MCAD組第2次再灌注后神經行為學評分低于MCAO組，BDNF陽性細胞數高于MCAO組，說明缺血預處理能夠減輕再次腦缺血的損傷，具有腦保護作用，與Kitagawa的研究相一致。通心絡組在各時程的BDNF表達均高于對應的PC－MCAO組，通心絡組第2次再灌注后BDNF的表達增高在第5天仍處于較高水平，而PC－MCAO組BDNF的表達在第3天達高峰之后降低，提示通心絡進一步使BDNF的表達增加，并能使BDNF的表達在較長時間維持于較高的水平。通心絡組第2次再灌注后24h，3d，5d的神經行為評分則低于對應的PC－MCAO組，顯示通心絡各組神經功能缺損較PC－MCAO各組減輕，與BDNF表達水平的變化具有一致性。在短暫腦缺血后給予通心絡治療能夠進一步增加BDNF的表達，增強腦的缺血耐受，更加減輕再次腦卒中所致的神經細胞損傷。

BDNF是一種多效能的神經營養因子，對腦的缺血性損傷具有抵抗作用，可誘導腦的缺血耐受，促進神經元功能的修復。研究發現，由于外源性BDNF難以通過血腦屏障，無論通過側腦室或靜脈給藥都不能很好發揮其保護作用，因此給予外源性通心絡增加內源性BDNF在缺血性損傷腦組織中的表達，是增進由缺血預處理誘導的腦的缺血耐受效應的重要途徑。

本文編輯 郭懷印