加味丹參飲預處理對乳鼠缺氧／復氧心肌細胞的延遲保護作用及對蛋白激酶Ｃ的影響

摘要：目的 觀察加味丹參飲預處理對乳鼠缺氧復氧心肌細胞的延遲保護作用及對蛋白激酶C(PKC)的影響。方法 將培養72 h的乳鼠心肌細胞隨機分為6組，空白組正常培養；血清對照組加50％大鼠血清培養；含藥血清組加50％含加味丹參飲的藥物血清培養；缺氧/復氧組予缺氧再給氧。缺氧預處理組、加味丹參飲預處理組先給予缺氧預處理和加味丹參飲預處理，24 h后再予缺氧再給氧。結果 加味丹參飲預處理24 h后可防止缺氧/復氧心肌細胞存活率的降低，防止乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性的升高(P＜0.01)，提高蛋白激酶C活性(P＜0.01)。結論 加味丹參飲預處理具有延遲保護作用，其機制與激發細胞內PKC信號轉導通路有關。

關鍵詞：加味丹參飲；預處理；延遲保護；心肌細胞；蛋白激酶C

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1672－1349(2007)10－0953－03

反復短暫缺血一再灌注以激發自身的適應性反應，使心肌對隨后發生的持續性缺血的耐受力提高稱為缺血預處理(IPC)。缺血預處理可防止心肌缺血再灌注損傷，具有良好的臨床應用前景。IPC對心肌的保護作用分為早期保護作用(EPC)與延遲保護作用(DPC)。目前關于中藥復方延遲保護作用的研究較少。本研究觀察加味丹參飲預處理的延遲保護作用，并觀察其對蛋白激酶C(PKC)的影響，以期為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 動物 出生72 h的Wistar大鼠30只，成年大鼠10只，體重(200±20)g，雌雄各半，均由廣西醫科大學醫學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK桂2003～0003。

1．1．2 藥物 加味丹參飲由丹參20g、檀香6g、赤芍10g、川芎6g、當歸6g、紅花6 g、生地12g等組成。由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥房提供，經干燥、稱重、浸泡、煎煮3次，濃縮至含生藥2g/mL。

1．1．3 儀器及試劑 凝膠成像分析系統(BIORAD公司)、U－2001紫外分光光度計(日立公司)、低溫高速離心機(Sigma公司)、PepTag非放射性蛋白激酶試劑盒(Promega公司)、WIP組織細胞裂解液(北京博奧森生物技術有限公司)、乳酸脫氫酶(LDH，南京建成生物工程研究所)、肌酸激酶(CK，南京建成生物工程研究所)、DMEM(Gibeo公司)、胎牛血清(杭州四季清生物工程材料有限公司)、牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司)。

1．2 方 法

1．2．1 體外大鼠心肌細胞的培養 參照《藥理實驗方法學》中新生大鼠心臟細胞的培養方法，將出生72 h的30只Wistar大鼠，無菌條件下剪取心室。剪下的心臟用PBS(磷酸緩沖液)洗滌后，剪去心房，將心室剪成1 mm³碎塊，用0.125％胰蛋白酶37℃水浴中消化10 min，棄上清，再加入胰蛋白酶液消化10min，將上清液及沉淀物分別處理。上清液移至另一無菌離心管中，加入PBS離心，棄上清液。重復(1～3)次，充分洗去胰蛋白酶。消化處理之后，將心肌細胞加入含20％胎牛血清的DMEM培養液中制成細胞懸液。將沉淀組織塊再加胰蛋白酶消化，沉淀，其上清液重復前述步驟，反復消化(3～8)次，制成心肌細胞懸液。將所有細胞懸液移到細胞培養瓶中，于37℃5％CO₂培養箱中放置1.5 h，除去已貼壁的成纖維細胞。收集未貼壁的細胞懸于含20％胎牛血清的DMEM培養液中，調細胞濃度為3×10⁶/mL，接種于25 cm²的培養瓶中，置于37℃，5％CO₂培養箱中培養。每2d更換培養液，取培養3d的細胞單層進行實驗。

1．2．2 心肌細胞缺氧復氧(H/R)損傷實驗法 參照《藥理實驗方法學》進行。DMEM培養液用高純氮氣飽和30 min，使培養液氧分壓低于4.00 kPa(30 mmHg)。心肌細胞單層換用缺氧培養液后。培養液內立即沖入氮氣(1L/min流量)30 s以驅除瓶內氧氣，然后塞緊瓶塞密閉培養。缺氧不同的時間后可造成心肌細胞不同程度的損害。按此方法造成心肌細胞缺氧，缺氧3h后換用正常DMEM培養液培養1h，造成再給氧損傷。

1．2．3 藥物血清制備 參照《藥理實驗方法學新技術與新方法》中方法。取10只Wistar大鼠按區組隨機法分為血清對照組和藥物血清組，分別制備對照血清和藥物血清。藥物血清組灌胃加味丹參飲藥液，劑量是根據成人每日臨床用量按人與動物之間藥物劑量換算而成(利用mg/kg折算mg/m2轉換因子”進行計算)，大鼠每日藥量為6.42 g/kg，每日2次，連續3d。血清對照組灌以等量生理鹽水。于最后1次給藥后1 h，無菌條件下，頸總動脈取血，分離血清；56℃、30min滅活補體ψ0.2μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，－20℃保存備用。

1．2．4 分組及給藥 將培養3d的乳鼠心室肌細胞隨機分為6組，每組6個樣本。空白組：繼續培養24h，更換培養液再培養24 h。空白血清對照組：培養液中加入50％大鼠血清培養24 h，然后更換培養液繼續培養24 h。含藥血清對照組：培養液中加入50％含加味丹參飲的藥物血清培養24 h，然后更換培養液繼續培養24 h。缺氧/復氧(H/R)組：繼續培養24 h，更換培養液再繼續培養24 h，然后缺氧3 h，再給氧1 h。缺氧預處理(HPC)組：繼續培養24 h，然后缺氧30 min，復氧30 min，更換培養液再繼續培養24 h，然后缺氧3 h，再給氧1 h。加味丹參飲預處理組：給50％含加味丹參飲的藥物血清培養24 h，然后更換培養液繼續培養24 h后予缺氧3 h，再給氧1 h。

1．2．5 PKC的提取與測定 參照WIP組織細胞裂解液說明書操作。每瓶細胞加入含PMSF的WIP裂解液(一般每次裂解5×10⁶1×10⁷細胞，每次用1 mL裂解液)，于冰上裂解30min。裂解完后，將細胞碎片和裂解液移至1.5 mL離心管中(整個操作盡量在冰上進行)。于4 ℃下12 000 r/min離心5min。將離心后的上清分裝轉移到0.5 mL的離心管中放于一20℃保存。

1．3 觀察指標

1．3．1 細胞存活率、LDH及CK活性測定 以臺盼藍染色法測定細胞存活率，取培養細胞上清液以比色法測定LDH，CK活性。

1．3．2 PKC測定 具體操作按PepTag非放射性蛋白激酶試劑盒說明書進行。0.5 mL離心管中依次加入反應緩沖液、PKC激活液、C1短肽，30℃預孵育2 min，加入樣品或對照，使反應總體積為25μL。充分混勻，30℃孵育30 min后，離心管置于95℃水浴中10 min以終止反應。每管加入85％的甘油1μL，充分混勻。0.8％瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后取膠紫外燈下觀察照相。切下磷酸化條帶，盡量使其體積接近250 μL，將其放入一個1.5 mL帶有刻度的離心管中，95℃加熱至膠溶解。取175 μL熱瓊脂糖，與75 μL凝膠穩定溶液、100 μL冰醋酸和150wL雙蒸水混勻。取500μL置于小杯中。570 nm比色，空白對照為液體瓊脂糖。根據Lamber－Beer定律：A＝εBC[式中：A為樣品的吸光度，ε為摩爾吸光系數(L/mol.com)，B為液層的厚度(比色皿的寬度)，C為PepTag C1短肽濃度(mol/L)]，計算摩爾吸光系數，并以此求得各樣品中磷酸化C1肽含量。結果以units/mL表示(指每分鐘每毫升轉移到底物的mol磷酸的數量，即單位酶的活性)。

1．4 統計學處理 數據以均數±標準差(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，用四川大學華西醫學院PEMS 3.1統計軟件進行統計。

2 結 果

2．1 各組PKC活性比較 含藥血清對照組、空白血清對照組PKC活性與空白組比較，無統計學意義(P＞0.05)。H/R組PKC活性最低，與其余各組比較，差異有統計學(P＜0.01)。HP℃組、加味丹參飲預處NAft PKC活性最高(P＜0.01)。詳見表1。

2．2 各組細胞存活率、LDH及CK活性比較 H/R組細胞存活率、LDH及CK活性最低，與其余各組比較有統計學意義(P＜0.01)。空白組、空白血清對照組、含藥血清對照組、H/R組、HPC組組間比較，細胞存活率、LDH及CK活性無統計學意義(P＞0.05)。詳見表2。2．3 各組電泳結果 加味丹參飲預處理組和HPC組PKC表達較其余各組高。

3 討 論

心肌預先反復短暫缺血后，可增強對后續較長時間缺血的耐受性，稱缺血預處理，是一種內源性機體保護機制。缺血預處理對心肌的保護作用分為兩個時期。EPK；于缺血預處理后即刻出現，(1～3)h逐漸消失，DPC于缺血預適應后十幾小時開始出現，于24 h后達到高峰，往往持續(72～96)h。雖然EPC也有心臟保護作用，但其作用時間窗較窄，必須在缺血再灌注損傷前短時間內給予，故臨床可操作性不強；相反，DPC作用時間跨度較大，在臨床運用時更有可行性和便利性，因此更具實用價值和開發意義。缺血預處理是一種強有力的心肌保護因素，但它畢竟是一種損傷性的過程，且由于缺血吋最佳時間、安全時限及體質差異等問題使其臨床應用受限制。因此，探討藥物預處理對缺血再灌注損傷心肌的保護已成為研究的熱點之一。由于中藥效果明顯、毒副反應較小等優點，更具有良好的臨床應用前景。

加味丹參飲在丹參飲基礎上化裁而成。因加味丹參飲主要用于治療缺血性心臟疾病，病位在心不在胃，故去原方之砂仁，加川芎、赤芍、當歸等藥。前期臨床與實驗研究已表明，加味丹參飲對冠心病人有較好降脂作用，對家兔食餌性動脈粥樣硬化具有顯著的防治作用，并具有模擬缺血預處理樣的心肌保護作用。由于在細胞培養中缺氧/復氧更具有可操作性，且缺氧/復氧的效果與缺血再灌注相似，因此在細胞培養中常用缺氧/復氧模型來代替缺血再灌注。心肌缺血損傷時，細胞膜完整性受破壞，CK，LDH外漏。因此，檢測CK，LDH活性可反映心肌細胞受損程度。本實驗結果表明缺氧/復氧可導致心肌細胞損傷，LDH、CK大量外漏，加味丹參飲預處理有延遲保護作用，能防止缺氧/復氧心肌細胞存活率降低，減少心肌細胞LDH，CK外漏。

PKC是一種Ca₂₊和磷脂依賴的蛋白激酶，已被廣泛認同為IPC的信號傳導級聯過程中共同通路。內源性生物活性物質啟動PKC的激活并轉位，是IPC；細胞保護的關鍵環節。從實驗結果可以看出，HPC組、加味丹參飲預處理組PKC明顯高于其他組(P＜0.01)。說明加味丹參飲預處理可通過激活PKC的細胞信號轉導通路而發揮延遲保護作用。

本文編輯 郭懷印