舒冠滴丸對動脈粥樣硬化兔ＣＤ４０通路調節作用研究

摘要：目的 觀察舒冠滴丸對動脈粥樣硬化斑塊CD40通路的調節作用。方法 運用高脂高膽固醇飼料造成兔動脈粥樣硬化模型，隨機分成模型組、舒冠滴丸組、辛伐他汀組，另設空白對照組。采用酶聯免疫吸附法測定血漿可溶性CD40L(sCD40L)、可溶性細胞間黏附分子－1(sICAM－1)和血管細胞黏附分子－1(sVCAM－1)濃度。然后，提取AS兔主動脈和心臟進行病理組織形態學觀察。結果 舒冠滴丸組血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)水平顯著低于模型組(P＜0.01)，舒冠滴丸組血漿sCD40L，sICAM－1水平明顯降低，與模型組比較有統計學意義(P＜0.01)，而血漿sVCAM－1水平無統計學意義；病理組織形態學觀察，舒冠滴丸組主動脈AS斑塊明顯少于模型組(P＜0.05)，冠狀動脈AS斑塊各組差異無統計學意義(P＞0.05)：舒冠滴丸組內膜病變較模型組明顯減輕，其內膜厚度、內膜／中膜厚度比、內膜／中膜面積比亦較模型組顯著減少(P＜0.01)。結論 舒冠滴丸具有調節血脂紊亂，減少動脈內膜斑塊數量，消退和穩定AS斑塊，降低血漿sCD40L，sICAM－1水平，其作用可能與抑制AS斑塊炎癥反應有關。

關鍵詞：舒冠滴丸；動脈粥樣硬化；細胞間黏附分子－1；細胞黏附分子－1：兔

中圖分類號：R543.5 R285.6 文獻標識碼：A 文章編號：1672－1349(2007)10－0958－03

近年來，越來越多的證據表明炎癥在不穩定動脈粥樣硬化(AS)斑塊的發生、演變及破裂過程中起著至關重要的作用。CD40－CD40L作為重要的炎癥信號通路，它的主要生物學效應之一是促進炎癥介質如血管黏附分子的釋放。細胞間黏附分子－1(ICAM－1)和血管細胞黏附分子－1(VCAM－1)表達增加可促進AS的慢性炎癥過程，同時增加AS斑塊的不穩定性，加快斑塊裂隙，促進斑塊破裂、血栓形成。因此，檢測外周血可溶性CD40L(sCD40L)、可溶性ICAM－1(sICAM－1)和可溶性VCAM－1(sVCAM－1)濃度可反映AS斑塊的炎癥程度和穩定性狀況。舒冠滴丸是在古方心救湯(《石室秘錄》)基礎上，結合多年臨床經驗研制的防治冠心病心絞痛的有效驗方，是以冰片、鵝不食草、三七、白芥子、肉桂、公丁香、紅參等為主要組成部分，功能芳香通脈、益氣溫陽、豁痰化瘀。本研究通過構建兔動脈粥樣硬化模型，觀察舒冠滴丸對AS斑塊CD40通路的調節作用，探討其抗動脈粥樣硬化的可能作用機制。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 清潔級健康日本雄性大耳白兔44只，平均體重2.0 ks(1.9 ks～2.5kg)，由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供。醫學實驗動物合格證：醫動字第20～003號。飼養條件：單籠分裝，室溫(25±2)℃，相對濕度65％±5％，實驗前動物在實驗飼養房內適應性喂養1周。實驗環境設施合格證號：醫動字第20-001號。

1．2 實驗藥物 舒冠滴丸每粒50 mg，由湖南中醫藥大學附一院藥劑科提供，批號：20001030。舒降之片(辛伐他汀，每片20mg)，由默沙東制藥有限公司提供，批號：20020530。

1．3 主要試劑、儀器 膽固醇粉(分析純，每瓶25 g，荷蘭進口上海試劑站分裝)，豬油(市售)，蛋黃粉(陜西天斗蛋業有限公司提供)；sCD40L試劑盒(奧地利Bender MedSysterns公司提供)sICAM－1，sVCAM－1試劑盒(法國DIACLONE公司提供)，L_D－A5型離心機(北京醫用離心機廠生產)，CL－7200全自動生化分析儀(日本島津公司)，721分光光度計(上海第三分析儀器廠制造)，TP－1000電子天平(湘儀天平儀器廠生產)，DG－3022A型酶聯免疫檢測儀(國營華東電子管制造廠制造)。

1．4 兔動脈粥樣硬化模型的建立及分組 將44只實驗動物隨機分成4組：空白組(8只)、模型組(12只)、舒冠滴丸組(12只)、辛伐他汀組(12只)。以上各組除空白組只給予標準全價營養飼料外，其余各組均每天每只給予高脂飼料100 g(含1.0 g膽固醇、7.5 g蛋黃粉、5.0 g豬油、86.5 g標準全價營養飼料)喂養8周，8周后隨機抽取高脂飼料喂養兔2只處死，取胸主動脈標本制作病理切片以證實產生粥樣硬化斑塊。動脈粥樣硬化模型造模成功后，舒冠滴丸組每只每日按人一兔等效量給藥[50mg/(kg·d)]，辛伐他汀組每只每日喂服辛伐他汀藥液[2.5mg/(kg·d)]，空白組、模型組灌飼蒸餾水10 mL，每組均給藥4周，均于上午給食前灌胃。所有動物自由飲水，繼續喂養4周。最終取得完整資料者進入分析，共28只，其中舒冠滴丸組7只。辛伐他汀組7只，模型組6只，空白對照組8只。

1．5 指標檢測方法

1．5．1 標本處理 各組均于12周后分別從兔頸動脈收集血樣(5～6)mL，注入10 mL肝素抗凝離心管，搖勻，3 500 r/min離心3 min，取上清血漿置于－70℃保存待測sCD40L，sICAM－1，sVCAM－1。同時測定血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL－C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)。

1．5．2 血漿sCD40L，sICAM－1，sVCAM－1的檢測 采用酶聯免疫吸附法測定血漿sCD40L，其檢測靈敏度為0.095ng/mL。采用夾心酶聯免疫吸附法測定血漿sICAM－1和sVCAM－1，其靈敏度分別為0.1 ng/mL和0.6 ng/mL，批內和批間誤差分別在1.03％～2.82％，3.93％～8.15％(sICAM－1)和0.45％～2.27％，0.144％～5.94％(sVCAM－1)。

1．5．3 血脂檢測 TC和TG采用酶法測定。即通過特殊氧化酶使底物生成過氧化氫，再通過氧化酶使它們結合成色原(生色團)，產生的顏色與分析物的量成正比，然后用比色法測定生色團的生成量。HDL－C采用磷鎢沉淀法，磷鎢酸－Mg²⁺可選擇性沉淀LDL和極低密度脂蛋白(VLDL)，上清液則為HDL。即在血清中分別加入MgCl₂和磷鎢酸液，充分混勻后離心，取上清液進行HDL－C測定。當濃度低于4.5 mmol/L時，VLDL中的膽固醇含量與血中TG濃度成完全線性關系。故可根據已知的HDL－C，TC和TG濃度計算出LDL－C濃度，即根據Friedewald公式[LDL－C(mmol/L)＝TC－HDL－C－TG/2.2]求得。

1．5．4 病理形態學觀察 12周末處死動物，取其心臟和主動脈大體標本(從近主動脈弓部到腹腔干分支處)，生理鹽水沖洗后沿正中線剪開，鋪平，置于10％中性緩沖甲醛液中固定48 h，常規酒精脫水，石蠟包埋，將其橫斷面制成4μm厚連續切片，經HE染色，光鏡下觀察攝像。采用德國遠東蔡司公司KS400圖像分析系統分別測定斑塊面積及內膜總面積，并計算斑塊/內膜面積比；從HE染色片上隨機選取5個視野，圖像分析儀測定內膜及中膜厚度、內膜及中膜面積，并計算內膜/中膜厚度比、內膜/中膜面積比。

1．6 統計學處理 采用SPSS10.0醫用統計軟件包進行數據資料的統計學處理，多組間比較采用One－way ANOVA檢驗，用Bonferroni方法進行兩兩比較，等級資料用秩和檢驗。

2 結 果

2．1 病理形態學觀察結果 血管大體觀察結果提示，空白組內膜光滑，未見指紋，無斑塊形成；舒冠滴丸組、辛伐他汀組和模型組均可見不同程度脂肪和粥樣斑塊隆起，模型組尤為明顯，斑塊連成片狀，從主動脈近端到遠端，斑塊逐漸減輕；舒冠滴丸組、辛伐他汀組斑塊明顯減少，除近端外，較少連成片狀，主要分布于血管分支處。經秩和檢驗，舒冠滴丸組與模型組比較，主動脈AS斑塊明顯少于模型組(P＜0.05)；與空白組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。冠狀動脈AS斑塊各組差異無統計學意義(P＞0.05)。詳見表1。

2．2 各組血漿sCD40L及血管黏附分子水平的變化 舒冠滴丸組、辛伐他汀組血漿sCD40L，slCAM－1水平明顯降低，與模型組比較有統計學意義(P＜0.01)；辛伐他汀組血漿sVCAM－1水平降低與模型組比較有統計學意義(P＜0.05)。舒冠滴丸組、辛伐他汀組兩組間無統計學意義。詳見表2。

2．3 各組血脂水平變化情況 舒冠滴丸組、辛伐他汀組、模型組各項血脂水平高于正常范圍，且血清TC，TG，LDL－C水平顯著高于空白組(P＜0.01)。而舒冠滴丸組、辛伐他汀組血清TC，TG，LDL－C水平顯著低于模型組(P＜0.01)，HDL－C水平則無統計學意義(P＞0.05)。舒冠滴丸組、辛伐他汀組兩組間無統計學意義。詳見表3。

2．4 病理細胞學觀察結果 HE染色可見，空白組主動脈內皮細胞排列完整，中膜外膜分界清楚，無泡沫細胞堆積及斑塊形成；冠狀動脈血管內皮完整、光滑，內膜不增厚，管腔無狹窄。模型組主動脈內膜顯著增厚，內皮不光滑不完整，斑塊隆起明顯，內含大量泡沫細胞；冠狀動脈內膜增厚，斑塊形成，管腔狹窄3/4。舒冠滴丸組和辛伐他汀組內膜可見部分增厚，內皮細胞排列較完整，其下有少量泡沫細胞堆積，有少許斑塊隆起，冠狀動脈血管腔狹窄1/2。舒冠滴丸組、辛伐他汀組斑塊/內膜面積比、內膜厚度、內膜／中膜厚度比、內膜／中膜面積比模型組顯著減少(P＜0.01)，而舒冠滴丸組、辛伐他汀組兩組間無統計學意義(P＞0.05)。詳見表4。

3 討 論

冠心病發生的主要病理基礎是AS的形成。在AS斑塊形成過程中，血管內皮的破損和內皮功能的減退，內皮通透性增加，血脂含量增加，炎性細胞浸潤，平滑肌細胞增殖、遷移和脂質氧化、變性以及血小板激活、細胞壞死、基質合成等發揮重要作用。

CD40L屬于腫瘤壞死因子超基因家族中的一員，CD40L以細胞膜結合或血液中游離狀態兩種形式存在，并與CD40結合產生一系列的炎性反應，包括促進黏附分子如血管黏附分子等物質的產生。近來的研究還提示，CD40L可通過調節粥樣斑塊的金屬蛋白酶表達，從而影響斑塊的穩定性。sICAM－1和sVCAM－1屬免疫球蛋白超家族分子，sICAM－1主要在內皮細胞表達，通過白細胞上的配體CD11/CD18復合物特異性結合，介導單核細胞、淋巴細胞、中性粒細胞與血管內皮細胞黏附。最近的研究發現激活血小板上的CD40L可上調血管內皮細胞的sVCAM－1、sICAM－1和E－選擇素的表達。Kotowicz等也發現，CD40L能顯著增加人體臍靜脈血管內皮細胞sICAM－1和sVCAM－1的表達。血管性黏附分子表達的增加將進一步促進炎癥細胞黏附于血管內皮，加速動脈粥樣硬化斑塊的不穩定性，損害斑塊表層纖維帽結構，促進斑塊破裂、血栓形成，從而導致急性冠脈綜合征的發生。

本研究通過構建兔動脈粥樣硬化模型，觀察舒冠滴丸對AS兔CD40通路的調節作用，結果表明舒冠滴丸能顯著降低TC，TG，LDL水平，升高HDL，具有調節脂質代謝紊亂，減少動脈內膜斑塊數量，延緩AS的進程，促進AS病變消退作用，降低血漿sCINOL，sICAM－1水平，抑制斑塊內的炎癥反應，延緩AS的進展，促進斑塊的穩定，可為臨床合理運用提供新的理論和實驗依據。

本文編輯 郭懷印