參麥注射液對(duì)腦出血大鼠血腫周圍區(qū)缺氧誘導(dǎo)因子１－α表達(dá)的影響

摘要：目的 探討參麥注射液對(duì)腦出血大鼠血腫周圍區(qū)缺氧誘導(dǎo)因子1一α(HIF1－α)表達(dá)的影響及其意義。方法 將50只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、參麥組，模型組和參麥組組內(nèi)又分為1d，3d，5d，7d共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采用立體定位儀定位注射膠原酶Ⅶ造大鼠腦出血模型，觀察大鼠腦出血后神經(jīng)病理體征改變．免疫組織化學(xué)法檢測(cè)血腫周圍區(qū)HIF1－α的表達(dá)，以及參麥注射液治療后的影響。結(jié)果 與模型組比較，參麥組大鼠神經(jīng)病理體征減輕明顯(P＜0.01)；正常組和假手術(shù)組腦組織神經(jīng)細(xì)胞無HIF1－α表達(dá)，而模型組血腫周圍區(qū)HIF1－α的表達(dá)1d時(shí)增多，3d時(shí)達(dá)到高峰，5d時(shí)表達(dá)下降，至7d時(shí)仍有少量表達(dá)，與模型組比較，參麥組各時(shí)間點(diǎn)的HIF1－α表達(dá)要少(P＜0.01)。結(jié)論 參麥注射液可能通過促進(jìn)血腫吸收、抑制血腫周圍區(qū)HIF1－α表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：參麥注射液；腦出血；血腫周圍區(qū)缺氧誘導(dǎo)因子1－α；大鼠

中圖分類號(hào)：R743.34 R289.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672－1349(2007)10－0949－03

原發(fā)性腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是指非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血，具有發(fā)病率、死亡率和致殘率高的特點(diǎn)，對(duì)個(gè)人、家庭和社會(huì)危害極大。既往已從體內(nèi)外研究證實(shí)了參麥注射液通過抗細(xì)胞凋亡對(duì)缺氧神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。現(xiàn)利用大鼠腦出血模型探討參麥注射液對(duì)腦出血大鼠血腫周圍區(qū)缺氧誘導(dǎo)因子1－α(hypoxia inducible factor 1－α，HIF1－α)表達(dá)的影響，從而進(jìn)一步闡述其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，為參麥注射液臨床應(yīng)用于腦出血的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠50只。雌雄各半，體重200g±20g，均購自湖南中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1．2 藥物、儀器和試劑 參麥注射液(每支20 mL，正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為0307136)，SN－3腦立體定位儀，微量注射器，AO－8205型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)，LHB11800型組織修整機(jī)，OVFON多功能光學(xué)顯微鏡，Ⅶ型膠原酶(Sigma公司)，鼠抗人HIF1－α(美國NOVUS公司)，SP試劑檢測(cè)盒(Sigma公司)，DAB檢測(cè)試劑盒(Sigma公司)。

1．3 方法

1．3．1 動(dòng)物造模 按Rosenberg法造大鼠腦出血模型：大鼠腹腔注射10％水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后，俯臥位固定于立體定位儀上，局部剪毛，75％乙醇皮膚消毒，頭皮正中切口，暴露顱骨。使用《大鼠腦立體定位圖譜》進(jìn)行蒼白球定位：前囟后1.4mm，中線右側(cè)旁開3.2mm，深5.6mm。手術(shù)刀鉆孔，用固定于立體定位儀上的微量注射器緩慢抽取含0.4 UⅦ型膠原酶的滅菌生理鹽水(0.2 U/μL)2 μL，校準(zhǔn)后垂直進(jìn)針5.6 mm，緩慢注射，留針5 min后拔出針頭，縫合皮膚，放回籠中飼養(yǎng)。假手術(shù)組以此方法注入等量滅菌生理鹽水。

1．3．2 分組與處理 將50只大鼠隨機(jī)分為4組，正常組5只，普通飼養(yǎng)，自動(dòng)飲水，不作任何處理；模型組20只，組內(nèi)再隨機(jī)分成腦出血后1d，3d，5d，7d共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，術(shù)前24h以2mL生理鹽水腹腔注射，術(shù)后仍用生理鹽水注射(每天1次)，直至處死為止；參麥組20只，動(dòng)物分配及用藥方法均同模型組，參麥注射液2 mL腹腔注射。假手術(shù)組5只，普通飼養(yǎng)，動(dòng)物分配及用藥方法均同模型組，術(shù)前24 h以2 mL生理鹽水腹腔注射，術(shù)后仍用生理鹽水注射(每天1次)，直至第3天處死為止。

1．3．3 評(píng)估 造模大鼠清醒后觀察大鼠軀體傾斜、立行欲倒、旋轉(zhuǎn)爬行、活動(dòng)遲緩、易激惹等情況。后按以下方法觀察爬桿記分，爬桿長2.0 m，寬2.4 cm，厚4.4 cm，一端抬高45度，術(shù)前3d訓(xùn)練大鼠由低向高爬行。具體計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為將爬桿等分為4段，每段計(jì)6分，4段總分相加共24分。不能爬計(jì)6分；患肢拖行計(jì)5分；跌下或滑倒＞3次計(jì)4分；跌下或滑倒＜2次計(jì)3分；四肢軟弱無力計(jì)2分；四肢支撐變寬計(jì)1分。其中24分為大鼠爬行記分的最高分，分?jǐn)?shù)越高，表示肢體功能越差。

1．3．4 大體標(biāo)本觀察 將實(shí)驗(yàn)大鼠以10％水合氯醛腹腔注射麻醉后，放血處死大鼠，迅速開顱取腦組織，生理鹽水輕輕洗凈血污后，觀察鼠血腫吸收情況。

1．3．5 免疫組化檢測(cè)血腫周圍區(qū)HIF1－α的表達(dá) 將腦組織按固定、脫水、石蠟步驟處理后，進(jìn)行連續(xù)矢狀切片(重點(diǎn)為出血中心區(qū)和血腫周圍組織)，片厚(5～10)μm，每個(gè)腦組織切片3張，按試劑盒提供的免疫組織化學(xué)程序檢測(cè)血腫周圍區(qū)HIF1－α的表達(dá)；HIF1－α表達(dá)陽性的細(xì)胞在光鏡下細(xì)胞漿或細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色顆粒。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：在40倍光學(xué)顯微鏡下觀察每張切片出血周圍區(qū)的每個(gè)網(wǎng)格(光學(xué)顯攝鏡40倍下為125μm×125 μm)的HIF1－α陽性細(xì)胞并計(jì)數(shù)。每個(gè)部位各觀察5個(gè)視野，取其均值作為出血周圍區(qū)的陽性細(xì)胞數(shù)。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)先做方差齊性檢驗(yàn)，方差齊者兩組樣本均數(shù)間比較用q檢驗(yàn)，方差不齊者作數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換變?yōu)榉讲铨R再行上述檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用χ²檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2．1 術(shù)后大鼠神經(jīng)系統(tǒng)病理體征 大鼠術(shù)后平均45 min麻醉清醒，遺留各種神經(jīng)系統(tǒng)病理體征。正常組和假手術(shù)組大鼠清醒后未見明顯神經(jīng)系統(tǒng)病態(tài)。模型組和參麥組大鼠清醒后神經(jīng)系統(tǒng)病態(tài)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表1。

2．2 大鼠爬釬記分結(jié)果 正常組及假手術(shù)組無明顯缺陷，模型組、參麥組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)爬桿計(jì)分比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；模型組、參麥組大鼠術(shù)后1d，3d，5d時(shí)爬桿計(jì)分比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。詳見表2。

2．3 標(biāo)本大體變化 正常組和假手術(shù)組均無出血，模型組和參麥組大鼠術(shù)后1d可見手術(shù)側(cè)腦腫脹，均出現(xiàn)血腫，術(shù)后3d血腫有所吸收，從第5天起出I址明顯減輕，術(shù)后7d明顯吸收，但參麥組相對(duì)吸收明顯。

2．4 血腫周圍區(qū)神經(jīng)細(xì)胞HIF1－α的表達(dá) 正常組及假手術(shù)組大鼠血腫周圍區(qū)均無HIF1－α的表達(dá)，而模型組和參麥組1d時(shí)血腫周圍區(qū)HIF1－α表達(dá)增多，主要在神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞漿，3d時(shí)達(dá)到高峰，5d時(shí)表達(dá)下降，至7d時(shí)仍有少量表達(dá)，與模型組相比較，參麥組各時(shí)間點(diǎn)的HIF1－α表達(dá)要少(P＜0.01)。兩組各時(shí)間點(diǎn)血腫周圍區(qū)HIF1－α表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)詳見表3。

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，大多數(shù)腦出血病人血腫在24 h內(nèi)將繼續(xù)擴(kuò)大，1d～3d達(dá)到高峰，血腫的壓迫、血腫中的凝血酶和血紅蛋白釋放等因素將會(huì)引起周圍腦組織缺血缺氧，導(dǎo)致血腫周圍腦水腫逐漸加重，腦血流量明顯下降，引起血腫周圍腦組織缺血缺氧，形成一缺血半暗帶。HIF1－α是氧調(diào)控信息傳導(dǎo)通路中的核轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)缺氧特別敏感，腦出血后的缺血缺氧將通過一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑引起細(xì)胞內(nèi)HIF1－α表達(dá)增多。已有研究表明，HIF1－α與缺氧半暗帶的神經(jīng)細(xì)胞凋亡成正相關(guān)，表達(dá)增多的HIF1－α能促進(jìn)腦出血后血腫周圍區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，加重腦出血后神經(jīng)細(xì)胞的損傷，惡化神經(jīng)缺損癥狀，在腦出血后的病理生理改變中扮演了重要的角色。

參麥注射液源于《千金要方》之生脈散，主要藥物為人參、麥冬，其主要功效為益氣養(yǎng)陰固脫。現(xiàn)代藥理研究表明，參麥注射液通過抗凋亡的作用而減輕神經(jīng)細(xì)胞缺血損傷，已在臨床上廣泛應(yīng)用于治療腦梗死，且取得較好的臨床療效。既往體內(nèi)的研究表明，參麥注射液可能通過上調(diào)血腫周圍區(qū)神經(jīng)細(xì)胞Bcl－2 mRNA的表達(dá)、下調(diào)Bax mRNA的表達(dá)、顯著的抗氧自由基、抑制鈣超載作用減輕大鼠腦出血后神經(jīng)病理體征，減少海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞凋亡而發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。體外神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)研究也發(fā)現(xiàn)，參麥注射液通過抗細(xì)胞凋亡在體外發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，但其作用的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制尚未完全明了。在本實(shí)驗(yàn)研究中，模型組及參麥組大鼠術(shù)后均出現(xiàn)了神經(jīng)功能缺損癥狀，兩組爬桿計(jì)分比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示參麥注射液能有效地減輕腦出血大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀；組織形態(tài)學(xué)觀察顯示模型組和參麥大鼠1d時(shí)均出現(xiàn)了血腫，3d時(shí)開始吸收，5d時(shí)血腫明顯吸收，7d后血腫局限，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致，但參麥組血腫吸收更完全，提示參麥注射液能促進(jìn)血腫吸收，從而減輕血腫引起的繼發(fā)缺血性損害。而免疫組化結(jié)果表明，腦出血后血腫周圍區(qū)神經(jīng)細(xì)胞HIF1－α的表達(dá)增多，在出血后3d時(shí)最高，與以往的文獻(xiàn)報(bào)道一致，且與血腫的高峰一致，但參麥組血腫周圍區(qū)神經(jīng)細(xì)胞HIF1－α的表達(dá)明顯要少，推測(cè)參麥注射液可能通過促進(jìn)血腫吸收，減輕血腫周圍區(qū)神經(jīng)細(xì)胞HIF1－α的表達(dá)，從而發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果進(jìn)一步為參麥注射臨床治療腦出血提供了一些理論依據(jù)。

本文編輯 郭懷印