高效液相色譜法測定氟康唑血藥濃度

摘 要:目的：探討測定血漿中氟康唑濃度的方法。方法：采用高效液相色譜(HPLC)法，以非那西丁為內標，KromailC18色譜柱(4.6mm×250mm)，以0.1mol/L磷酸-磷酸二氫鉀緩沖液-甲醇(50∶50，v/v，pH7.0)為流動相;流速1.0mL/min;柱溫:30℃;在波長210nm處測定其含量。結果：以氟康唑峰面積和內標峰面積比(Y)對氟康唑濃度(X)回歸分析，方程:Y=0.1769X－0.0449，r=0.9995(n=7)，線性范圍為:0.3204～20mg/L。提取回收率>86.0%(n=5)，方法回收率為94.1%～103.2%，日內RSD≤3.34，日間RSD≤5.67%，且穩定性良好。結論：本方法與GC、HPLC及其它生物學方法相比，大為優化，完全能滿足人體藥動學及生物等效研究的要求，可以作為此方面研究的可靠分析方法。

關鍵詞：氟康唑;高效液相色譜法；血藥濃度

中圖分類號：R917文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2007）12-033-03

氟康唑(Fluconazole，FCZ)是新型三唑類抗真菌藥物，能特異、有效地抑制真菌的甾醇合成，口服及靜脈注射(靜注)對各種動物真菌感染，如念珠菌感染、新生隱球菌感染、小孢子菌屬感染及毛癬菌屬感染均有效。據文獻報道，本品口服吸收良好，生物利用度可達靜注給藥的90%以上。口服1～2h后，一般血藥濃度可達峰值，血漿消除半衰期約為30h，血藥濃度與劑量成正比。血漿蛋白結合率較低，一般為11%～12%，給藥劑量的80%以原型藥隨尿液排除。患者一般對本藥能很好地耐受，常見的副作用有惡心、腹痛、腹瀉、胃腸脹氣、皮疹等，亦可產生肝酶升高。目前，國內已有多家藥廠生產。本研究運用高效液相色譜法(HPLC)對氟康唑血藥濃度進行了測定，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與藥品

儀器:日本島津公司LC-10A泵，KromailC18色譜柱(4.6mm×250mm)，SiL-10A全自動進樣器，SPD-10A型紫外可見分光光度檢測器(190～600nm)，NC-2000型色譜工作站，TCL-16G高速臺式離心機，超聲波發生器，YKH-Ⅱ型液體快速混合器(江西醫療器械廠)。試劑:甲醇色譜純(山東省禹王實業總公司化工廠)，其它試劑均為分析純，水為重蒸餾水，氟康唑對照品由中國藥品生物制品檢定所提供。內標溶液(0.25mg/mL):精密稱取非那西丁適量，加水溶解并稀釋成0.25mg/mL，搖勻，置冰箱中冷藏備用，臨用時稀釋成0.25μg/mL。標準溶液(0.25mg/mL):精密稱取氟康唑適量，加水溶解并稀釋為0.2mg/mL，搖勻，置冰箱中冷藏備用，臨用時稀釋成1.0、5.0、25.0、50.0和100.0μg/mL的應用液。 

1.2 血漿中氟康唑HPLC測定法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:KromailC18色譜柱(4.6mm×250mm)，流動相:0.1mol/L磷酸-磷酸二氫鉀緩沖液-甲醇(50∶50，v/v，pH7.0);流速:1.0mL/min;檢測波長:210nm;柱溫:30℃。檢測器靈敏度0.01AUFS，20μL定量環進樣。

1.2.2 血漿樣品處理方法 精密吸取血漿樣品1.0mL置于具塞離心管中，加100μL非那西丁內標溶液(0.25μg/mL)，200μL氫氧化銨溶液(1.5mol/L)，乙酸乙酯7.0mL，置于YKH-Ⅱ型液體快速混合器中混勻30s，離心5min(4000r/min)，分離有機相置于55℃水浴上以氮氣吹干，殘余物以甲醇100μL溶解，取20μL進樣分析。

1.2.3 方法的專屬性 將受試者服藥前空白血漿、空白血漿加內標和氟康唑標準品及受試者服藥后血漿樣品同法處理后進樣，見譜圖1。

1.3 分析方法

1.3.1 血漿標準曲線的繪制 取空白血漿1.0mL5份分置于具塞離心管中，依次加入上述FCZ標準系列溶液100.0μL，按血漿樣品處理方法處理后經HPLC測定，以氟康唑峰面積和內標峰面積比(Y)對氟康唑濃度(X)回歸分析，方程:Y=0.1769X－0.0449，r=0.9995(n=7)，線性范圍為:0.3204～20mg/L。

1.3.2 回收率試驗 用空白血漿和標準液制成濃度分別為10.0mg/L、2.5mg/L、0.625mg/L的樣品各5份，同法操作，進樣，氟康唑峰面積為A1，另取相應氟康唑標準液進樣，氟康唑的峰面積為A2。按公式：提取回收率(F)=(A1/A2)×100%計算;用空白血漿與標準液制成濃度分別為10.0mg/L、2.5mg/L、0.625mg/L的樣品各5份，同法操作，以測得值除以實際濃度值計算方法回收率。測得提取回收率結果分別為(89.2±2.63)%、(91.1±5.03)%、(88.9±2.88)%，方法回收率分別為(97.2±3.13)%、(99.1±2.03)%、(100.9±2.31)%。低、中、高濃度時，提取與方法回收率均符合生物樣品分析的要求。

1.3.3 精密度試驗 在同一日內，用空白血漿與標準液制成濃度分別為10.0mg/L、2.5mg/L、0.625mg/L的樣品各5份，同法操作，計算;同法配制濃度為10.0mg/L、2.5mg/L、0.625mg/L樣品，同法測定，連測5ｄ，計算。結果見表1。低、中、高濃度時，該方法的精密度符合生物樣品分析的要求。

1.3.4 穩定性試驗 用空白血漿與標準液制成濃度分別為5.0mg/L^-1、2.5mg/L^-1、0.625mg/L^-1的樣品，于室溫(25℃)放置8ｈ后，同法操作，計算;于-40℃冰箱中冷凍24ｈ后，取出完全融化，反復凍融3次(3ｄ)后，同法操作，計算;于-40℃冰箱中放置7、14、21、28、35ｄ后，同法測定，計算。本試驗樣品穩定性符合生物樣本分析過程要求。結果見表2。

2 討論

本試驗采用高效液相色譜法，用醋酸乙酯提取血漿中氟康唑，快速混合1min，一次提取，能有效提取氟康唑并減少了其它物質的干擾，提取回收率高，基線平穩，雜質峰少，分析時間縮短。試驗中發現，適當增加非那西丁的用量，可以使內標色譜峰面積加大，結果更準確，更有利于分析。檢測波長為260nm時，對濃度為0.3125mg/L的樣品測定，靈敏度達不到分析要求。將同一樣品在不同波長(260nm，210nm)處進行測定，可知，血漿樣品在260nm時，樣品峰很小，積分困難;而在210nm處樣品峰很大，容易積分。光譜圖掃描亦可知，樣品在260nm處吸收很不明顯，而在210nm處有明顯吸收。經過多次試驗，選擇甲醇-磷酸鹽緩沖液(50∶50，ｖ/ｖ)作為流動相，檢測波長選擇在210nm處，一改以往文獻中采用乙腈-磷酸為流動相、檢測波長在260nm附近的色譜條件。在本試驗色譜條件下，能很好地分離內標、氟康唑及內源性雜質，峰形良好，且縮短了分析時間。

綜上所述，本實驗所用的測定氟康唑血藥濃度的方法與GC、HPLC及其它生物學方法相比，大為優化，完全能滿足人體藥動學及生物等效研究的要求，可以作為此方面研究的可靠分析方法。

參考文獻：

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