ＲＮＡｉ的發展與應用

摘 要:RNAi作為一種調控特定基因表達的手段，被稱為基因組的免疫現象，已成為最近生物醫學領域的研究焦點之一，其發現為疾病治療提供了全新的途徑，并給整個生物理論界帶來了巨大而深遠的影響。簡要介紹了其機制和應用。

關鍵詞：RNAi；RNA；基因組免疫現象；生物醫學

中圖分類號：R329.2+8文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2007）12-025-04

RNAi（RNAi interference）是指通過反義RNA與正鏈RNA形成雙鏈RNA特異性地抑制靶基因的轉錄后表達的現象，它通過人為地引入與內源靶基因具有同源序列的雙鏈RNA（有義RNA和反義RNA），從而誘導內源靶基因的mRNA降解，達到阻止基因表達的目的 ^[1] 。人工合成的siRNA（small interfering RNA）是長度為21～25 核苷酸大小的小RNA分子，可以與RISC共同發揮作用，使沉默復合物識別靶目標。在生物體中導入dsRNA，可引起體內同源基因特異性沉默，當病毒RNA侵入細胞后，RNAi就是機體監視系統的成員，可檢測病毒信息，降解病毒核酸和蛋白，維持宿主基因組的穩定性，保護機體不受病毒侵犯^[2] 。自從1998年Fire等^[3]提出siRNA以來，幾年間人們對它的認識和應用速度是驚人的。RNAi現象的發現及其分子生物學機制和功能的深入研究，為成功地應用RNAi研究與治療病毒感染、免疫缺陷疾病和腫瘤等重大疾病提供了理論基礎。^[4]

1 歷史

1993年報道， 將產生紫色素的基因轉入開紫花的矮牽牛中，希望使紫色加深，可是，非但沒有加深紫色，反而成了白色。當時認為這是矮牽牛本來有的紫色素基因和轉入的外來紫色素基因都失去了功能，稱為“共抑制”。1995年，康奈爾大學Su Guo博士在用反義RNA阻斷線蟲基因表達的試驗中發現，反義RNA和正義RNA都阻斷了基因表達，他們對這個結果百思不得其解^[5]。1998年，Andrew Fire研究證明，在正義RNA阻斷了基因表達的試驗中，真正起作用的是雙鏈RNA，這些雙鏈RNA是體外轉錄正義RNA時生成的，于是提出了RNAi這個詞。2002 年，Zer2nicka -Coetz 等首次在哺乳動物中發現RNAi^[6]。同年，Judy Lieberman 和Premlata Shankar 報道了在動物中利用RNAi 技術治療疾病的研究進展^[7]。研究發現，在出現共抑制現象的植物中有一類25 nt的RNA ;加入果蠅胚胎溶解物的dsRNA 會斷裂為21～25 nt 的片斷;內源性mRNA 在與導入dsRNA 的結合部位也被切割成21 ～ 25 nt 的片斷， 為RNAi 機制的重要中間效應分子， 命名為siRNA (small interfering RNA) ^{[8 ， 9 ]}。

2 生物進化

許多真核生物中都發現了RNAi現象，而在原核生物中卻未發現，提示了RNAi的進化地位，但是其在進化中是如何出現，如何保存下來，在生物體中的意義有多大，目前均沒有明確，還需要更多研究來闡明。 ^[5]

3 重要意義

RNAi 受到追捧的原因主要有兩方面：①RNAi 可以說是基因功能檢驗的試金石，利用 RNAi 技術可以縮短對人類基因功能了解和認識的時間，在不久的將來有望將人類大部分基因的功能和作用全部弄清楚；②科研人員有望利用這種技術獲得使致病基因失活的新型基因藥物，而基因藥物一直是生物技術界追捧的對象。^[10]

4 RNAi 作用機制與特點

4.1 機制模型^[11-14]

RNAi 發生過程大致為3階段:①起始階段。dsRNA在細胞內Dicer均勻切割成21~23nt大小siRNA。dsRNA 可以是外源的，也可以是內源的。siRNA長短是種族特異的，5′端是磷酸的，3′端往往突出2 個nt。②擴增階段。siRNA 與mRNA 靶向性結合，并作為引物，在RdRp 作用下再次形成dsRNA ，dsRNA 又被Dicer切割成siRNA ，新形成的siRNA 又可以進入下一輪循環而達到擴增目的。③效應階段。 siRNA 和內切核酸以及其它蛋白一起形成RISC (RNA-induced silencing complex)。RISC的核酸部分起到靶向性作用，蛋白部分則起到降解mRNA 的作用^[15] 。

4.2 作用特點

(1)21～23 nt dsRNA 為降解靶基因的中介分子。 Phillip 等發現，501bpPr-dsRNA、505bpPr-dsRNA 在胚胎裂解物中孵育時，約15 %生成了穩定存在的21～23 nt RNA 片段，而且不要求有相應的mRNA 存在， 這證實了小片段RNA 由長dsRNA 切割而來，而不是dsRNA 針對的靶基因mRNA 的產物。進一步研究表明，21～23nt dsRNA7 為降解靶基因的介質分子，決定切割位置。

(2) 細胞RNAi 裝置具有飽和性。Susan 等發現，RNAi 反應中特異性dsRNA 到達一定濃度后不可再增加，而非特異性dsRNA 濃度可以改變。研究還發現，隨著非特異性dsRNA 濃度增加，特異阻抑反應逐漸減弱。

(3) RNAi 作用廣泛。Fire 等在新小桿線蟲中發現，dsRNA 介導RNAi 不僅在導入部位產生阻抑效應，而且可以跨越細胞界限彌散到其它腔道和組織，發揮阻抑作用。

(4) RNAi 需要ATP 參與。Phillip 等發現，當ATP 水平由250μmol 降至10μmol 以下，加入外源性ATP ，針對靶基因的dsRNA 沒有阻抑基因的表達，因此證明在體外RNAi 是需要ATP 合成的，外源性ATP 不可取代。進一步研究發現，在ATP 合成缺失的裂解物中不能發生RNAi 。

(5) RNAi 過程不需蛋白輔助。Phillip 等用環己亞胺等合成拮抗劑，發現RNAi 仍以正常效率作用，說明RNAi 中不需合成蛋白輔助產生阻抑效應。

(6) RNAi 作用的靶基因有一定的選擇性。Andrew 等發現，保守基因更易產生RNAi 效應，

而且神經元細胞較其它類型細胞對RNAi 不敏感。參與精子運動的基因也很少能夠發生RNAi 效應。^[17] 

5 應用進展

5.1 腫瘤抑制中的進展 

傳統技術誘導的單個癌基因的阻斷往往不可能完全抑制或逆轉腫瘤細胞的生長，也很難達到預期的治療效果，而利用siRNA干涉技術能異地抑制癌基因、癌相關基因或突變基因過度表達，使基因保持靜寂或休眠狀態，且抑制效果互不干擾，從而有望達到抗腫瘤作用。

5.2 拯救病毒或創造新病毒 

根據一些病毒的已知核酸序列，采用反向遺傳學操作技術可以構建出“人為設計”

的病毒，得到以人工合成的寡核苷酸或已消失的病毒核酸序列為基因組的新型病毒，這給通過獲得高免疫原性的低致病力毒株來制造疫苗提供了全新的途徑。也可在生產疫苗時，將流行毒株與高產毒株進行基因重配，得到同時具有高產特性和流行毒株抗原性的重組毒株，以提高疫苗產量。^[18]

5.3 凋亡輔因子研究中的應用^[19]

人類flap 內切核酸酶(FEN21) 涉及DNA 復制及修復，FEN21 在DNA 復制期間對于處理岡崎片段很重要，但是Parrish 發現，編碼線蟲FEN21 同系物的crn21 ，其蛋白產物作為CPS26PEndoG的輔因子，可以介導凋亡DNA 片段化，而且其對凋亡的正常進行很重要^[20]。細胞死亡相關核酸酶(cell death2related nucleases ， CRN21) 定位于細胞核， 利用CPS26的內切核酸酶活性、CRN21的5′2 3′外切核酸酶活性及其缺口依賴性、內切核酸酶活性，CRN21 能結合并協同CPS26促進DNA 逐步片段化。用RNAi 減少crn21 的活性則會引起死亡細胞表型，這些表型類似于缺乏CPS26PEndoG的突變體所展示的表型。研究者證實，CRN21 能生理性結合CPS26 ， 而CPS26PCRN21 蛋白相互作用也能在體外刺激蛋白核酸酶活性。這些結果表明，涉及DNA 復制和修復的CRN21 也能作為凋亡核酸酶CPS26 的輔因子。

5.4 基因治療

針對有害基因序列設計dsRNA ，將dsRNA 導入生物體內，或讓dsRNA 在生物體內轉錄，利用dsRNA 引發其同源內源有害基因的mRNA 序列的降解，從而可達到抑制該有害基因表達的目的，包括各種人類疾病，特別是腫瘤^[21]和遺傳病的相關基因。Brummelkamp 等用逆轉錄病毒載體將siRNA 導入腫瘤細胞，特異性抑制了癌基因K RAS(V12) 的表達。Scherr 等以引起慢性髓性白血病和bcrabl 陽性急性成淋巴細胞白血病的癌基因為靶基因設計了對應siRNA ，并獲得了87 %的有效抑制率。Elbashir 等成功將Hela 細胞中編碼核有絲蛋白、核纖蛋白的基因同時敲除。Wilda 等用siRNA 抑制白血病BCRPABL 融合基因表達也取得了成功^[22]。Manus 等開展了對T 細胞的CD4PCD8 同時敲除的實驗^[21]。

5.5 自身免疫治療

國外有人用siRNA來考察對不同鼠急性肝衰竭模型的治療效果。他們在腺病毒表達的Fas配體介導的肝衰竭過程中，在不同時間點給鼠注射caspase8siRNA，以抑制caspase8基因在肝臟的表達，結果防止了Fas介導的細胞凋亡，保護了肝臟，減弱了Fas抗體或腺病毒表達的Fas配體誘導的急性肝衰竭，使鼠的存活率有很大改善，說明siRNA有較大的希望用于治療患者的急性肝衰竭。另外，使用RNAi技術還可直接干擾Fas的表達，達到治療的目的。^[23]

6 不足

Fraser等在研究中發現，RNAi不能作用于某些基因和細胞類型（如神經元），一些低水平表達的基因的RNAi現象并不明顯，如果幾個基因有相同或者近似的序列，RNAi會同時作用于它們，這樣，所觀察到的表型就不能肯定是由哪些基因被干擾所產生的。在醫學上，RNAi主要用于抗RNA病毒感染，而對DNA病毒的嘗試很少，從RNAi作用機制來看，RNAi技術同樣可以用于DNA病毒的防治。另外，對RNAi的研究目前是在體外培養細胞中進行的，離臨床運用還有距離。^[25]

7 結論

siRNA與RNAi技術真正應用于日常生活還為時尚早，需要科學家們進一步廣泛深入、細致持久的研究。盡管如此，我們依然可以預測，與其它基因技術一樣， siRNA與RNAi技術將在不久的將來在基因治療和基因應用中發揮極大作用，并將給整個生物理論界帶來巨大而深遠的影響。^[5]

參考文獻：

［1］ Zhu Rui，Zhang Kai-li，Zou Xiang-yang.RNA interference technique and dusing in study of functional genomics［J］.Journal of DaLian Medical University，2003，2（25）:105-107.

［2］ 康潔，劉福林.RNAi，生物體內的基因免疫［J］.生物學通報，2004，8（39）:16-17.

［3］ Fire A，Xu S，Montgometry MK.Potent and specific genetic inter-ference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，1998，391（6669）:806-811.

［4］ 于洋. RNA 干涉的研究歷史、現狀和展望［J］ . 黑龍江畜牧獸醫，2003(11):68-69.

［5］ 鄧凡，羅深秋. dsRNA 介導的RNA 干擾［J］ . 生命的化學2001(4):268-270.

［6］ 孟國良，湯富酬，張俊爭. 小鼠胚胎干細胞中RNA 干涉現象［J］.生物化學與生物物理學報，2003 ，35(3) :238 -246.

［7］ 雷迎峰，薛小平，尹文. RNAi 研究進展［J］ . 國外醫學(分子生物學分冊) ，2002(4) :196 -199.

［8］ 孫建國，廖榮霞，陳正堂. RNA 干涉分子機制研究進展［J］.生物化學與生物物理進展，2002(5) :678 -681.

［9］ Wilda M，Fuchs U，Wossmann W.Killing of leukemic cells with a BCR/ABL fusion gene by RNA interference［J］.Oncogene，2002，21（37）:5716-5724.

［10］ Cioca D P，Aoki Y，Kiyosawa K.RNA interfering is a functional path-way with therapeutic potential in human mycloid leukemiaceu lines［J］.Can-cer Gene Therapy，2003，10（3）:125-133.

［11］ Brummelkamp T R，Bernards R，Agami R.Stable suppression of tumori-genicity by virus mediated RNA interference［J］.Cancer Cell，2002，（3）:243-247.

［12］ Elbashir S M，Harbotth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of21-nu-cleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells ［J］. Nature，2001，411（836）:494-498.

［13］ Lin S L，Chuong C M，Ying S Y.A novel mRNA-cDNA interference phenomenon for silencing bel-2expression in human LNCaP cells［J］. Biochem Biophys Res Commun，2001，281（3）:639-643.

［14］ Schrijver ED，Brusselmans K，Heyns W.RNA interference mediat-ed silencing of fatty acid synthase gene attenuates growth and induces morphological changes and apoptosis of LNCaP prostate cancer cell［J］.Cancer Res，2003，63（6）:3799-3804.

［15］ 許小亮， 李君武. RNAi技術在臨床中的運用［J］. 廣東醫學院學報， 2005 （3）：23-24.

［16］ Neema Agrawal， P. V. N. Dasaradhi， Asif Mohmmed， Pawan Malhotra，Raj K. Bhatnagar， Sunil K. Mukherjee.*RNA Interference: Biology， Mechanism， and Applications［J］.International Center for Genetic Engineering and Biotechnology， 2006，35(5):2354-2357.

［17］ 陳燕飛.RNAi技術及其應用［J］.韶關學院學報#8226;自然科學， 2006 (12):33-34.

［18］ 蔣玲艷，王林果.反向遺傳學技術及其應用［J］.韶關學院學報#8226;自然科學，2006(32):19-21.

［19］ 黃璐，李新平，霍黌琦.RNAi 技術在凋亡研究中的應用［J］.醫學綜述，2006(12):12-14.

［20］ Parrish JZ ，Yan Chongling ，Shen Binghui . CRN21 ，a C. elegans FEN21 homologue ，cooperates with CPS26PEndoG to promote apoptotic DNA degradation［J ］ . EMBO J ，2003 ，22(13) :345123460.

［21］ 朱睿，張開立，鄒向陽. RNA 干擾(RNAi) 技術及其在功能基因組學研究中的應用［J ］ . 大連醫科大學學報，2003 (6) :105.

［22］ 李剛，李湘平. RNAi 研究現狀與進展［J ］ . 廣東醫學，2003(3) :327 -329.

［23］ 李小燕.RNAi技術在藥物研究中應用范圍日趨廣泛［J］.中國醫藥報，2004(5):67-69.

［24］ 高民. RNAi技術在醫學上的應用研究進展［J］.中華醫學研究雜志，2005，5（3）:89-93.

［25］ Fraser A G，Kmath R S，Zipperlen P.Functional genomic analysis of C elegans chromosome1by systematic RNA interference［J］.Nature，2004(08):325-330.