維生素Ｃ生產(chǎn)工藝研究進(jìn)展

圖分類號：R9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1533(2007)12-0559-04

維生素C（Vitamin C，VC）主要存在于生物組織中，在新鮮水果、蔬菜和動物肝臟中的含量尤為豐富。VC的化學(xué)名稱為L(+)-蘇阿糖型-2，3，4，5，6-五羥基-2-己烯酸-4-內(nèi)酯，分子式為C6H8O6，分子量176.13。

VC是一種人體必需的水溶性維生素，也是一種抗氧化劑，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料、化妝品等諸多領(lǐng)域，具有廣闊的市場前景。為了提高VC的質(zhì)量和收率，國內(nèi)外一直在對其生產(chǎn)工藝不斷地進(jìn)行改進(jìn)。

1 萊氏法

萊氏法是1933年德國化學(xué)家Reichstein等發(fā)明的最早應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)VC的方法。該法以葡萄糖為原料，經(jīng)催化加氫制取D-山梨醇，然后用醋酸菌發(fā)酵生成L-山梨糖，再經(jīng)酮化和化學(xué)氧化，水解后得到2-酮基-L-古洛糖酸（2-KLG），再經(jīng)鹽酸酸化得到VC。萊氏法生產(chǎn)的VC產(chǎn)品質(zhì)量好、收率高。由于生產(chǎn)原料廉價(jià)易得，中間產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，至今仍是許多國外VC生產(chǎn)商，如Roche公司、BASF/ Takeda 公司和E.Merck公司等廠商采用的主要工藝方法。但是萊氏法也存在不少缺陷，諸如生產(chǎn)工序多、勞動強(qiáng)度較大，使用大量有毒、易燃化學(xué)藥品，容易造成環(huán)境污染等。為此，自20世紀(jì)60年代起，各國學(xué)者一直致力于萊氏法的改進(jìn)。

2 二步發(fā)酵法

20世紀(jì)70年代初，中國科學(xué)院微生物研究所和北京制藥廠合作，研制成功了“二步發(fā)酵法” 制備VC的新工藝［1］。該法以生物氧化過程代替萊氏路線中的部分純化過程，簡化了生產(chǎn)工藝，降低了生產(chǎn)成本，減少了“三廢”污染，多年以來一直被國內(nèi)廠家使用。二步發(fā)酵法生產(chǎn)VC可以分為發(fā)酵、提取和轉(zhuǎn)化三大步驟，即D-山梨醇先經(jīng)細(xì)菌氧化為L-山梨糖，再通過細(xì)菌發(fā)酵生成VC前體2-KLG，最后用化學(xué)法將2-KLG轉(zhuǎn)化為VC。在幾十年的工藝發(fā)展中，二步發(fā)酵法工藝不斷地得到了改進(jìn)。

2.1 發(fā)酵工藝

二步發(fā)酵法的生物轉(zhuǎn)化過程如下：

2－KLG

其中，D-山梨醇轉(zhuǎn)化為L-山梨糖是由黑醋酸菌完成的，該工藝在萊氏法中就已使用，由于工藝成熟且生物轉(zhuǎn)化率高（98％以上），因此在二步發(fā)酵法中得以延用。近年來，國內(nèi)外對這項(xiàng)工藝的研究甚少，研究方向主要集中在二步發(fā)酵法的第二步，即由L-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-KLG。該步為混菌發(fā)酵，目前其代謝機(jī)制尚不清楚，也未得到相關(guān)基因。自二步發(fā)酵法發(fā)明推廣以來，國內(nèi)外對該步的研究［2］除了優(yōu)化發(fā)酵工藝外，主要集中在大、小菌的關(guān)系和優(yōu)良菌株的選育方面。

VC工業(yè)生產(chǎn)常用的小菌為氧化葡萄糖酸桿菌，大菌為巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌或條紋假單孢桿菌。焦迎暉等［3］通過分析VC二步發(fā)酵過程中活菌數(shù)、產(chǎn)酸量、pH值和糖酸轉(zhuǎn)化活力等，進(jìn)一步證實(shí)了小菌具有將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-KLG的能力，而大菌本身不產(chǎn)酸，其作用僅僅是通過刺激小菌的生長而促進(jìn)小菌產(chǎn)酸。馮樹等［4］研究發(fā)現(xiàn)大菌的胞外液還具有促進(jìn)小菌轉(zhuǎn)化L-山梨糖生成2-KLG的作用，具有該作用的組分的分子量包括30 - 50 kD和大于100 kD兩部分，其中前者是一種含鐵和鋅的蛋白質(zhì)。

劉禎等［5］發(fā)現(xiàn)一株葡萄糖酸桿菌正向突變株，該菌株前期生長及產(chǎn)酸明顯高于生產(chǎn)菌株201C，經(jīng)流加發(fā)酵工藝培養(yǎng)，可縮短發(fā)酵周期8 h，山梨糖生成2-KLG的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)80％。陳建華等［6］用配對法篩選得到氧化葡萄糖酸桿菌10-3的優(yōu)良伴生菌短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）97002，混合菌發(fā)酵生產(chǎn)2-KLG，山梨糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)90％。

2.2 提取工藝

二步發(fā)酵法兩次發(fā)酵以后，發(fā)酵液中僅含8 %左右的2 - KLG，而殘留菌絲體、蛋白質(zhì)、多糖或懸浮微粒等雜質(zhì)的含量卻很高。這給2-KLG的分離提純帶來了很大困難，致使后處理費(fèi)用占總成本的比例較大。目前，VC工業(yè)生產(chǎn)中常用的2-KLG的分離提純方法有加熱沉淀法、化學(xué)凝聚法和超濾法。

2.2.1 加熱沉淀法

加熱沉淀法是2-KLG分離提純的傳統(tǒng)工藝，分離手段較為落后。此工藝通用氫型樹脂，調(diào)pH至蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)后加熱除蛋白。采用此工藝會造成有效成分在高溫下降解損失，且發(fā)酵液直接通過樹脂柱，造成樹脂表面污染，降低樹脂的交換容量和收率。兩次通過樹脂柱帶進(jìn)了大量水分，也增大了濃縮耗能。

2.2.2 化學(xué)凝聚法

化學(xué)凝聚法是通過加入化學(xué)絮凝劑來除去蛋白質(zhì)、菌體、色素等雜質(zhì)，避免了加熱沉淀時(shí)有效成分的損失。季光輝等［7］采用化學(xué)凝聚法對VC發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，使2-KLG的濾液質(zhì)量提高，提取前步收率提高5.2％，VC總收率提高2.5％以上。陳雷等［8］以殼聚糖為主凝劑，聚丙烯酰胺為助凝劑，通過化學(xué)凝聚法除蛋白工藝，提取收率由原來的76％提高到82％，古龍酸優(yōu)級品率由原來的35％提高到60％，成本比原來降低20％。

但是，化學(xué)凝聚法也存在不足，主要表現(xiàn)在處理后的發(fā)酵液離心后所得的上清液中仍然存在一定量的蛋白，如發(fā)酵液染菌則處理的效果更不明顯，上清液渾濁，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的質(zhì)量和收率。此外，所用的化學(xué)絮凝劑也可能對環(huán)境造成污染。

2.2.3 超濾法

超濾是一種新興的膜處理技術(shù)，此法具有操作方便、節(jié)能、不造成新的環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)，因此在2-KLG的分離提純中的應(yīng)用日益廣泛［9］。此法與加熱沉淀法不同的是，可在常溫下操作，可減少有效成分的損失；在用膜除蛋白的過程中，無任何新的化學(xué)物質(zhì)加入，可減少對樹脂的污染和損耗，降低酸堿用量，減少三廢排放。與化學(xué)凝聚法不同的是，在處理染菌的發(fā)酵液時(shí)仍可達(dá)到較好的處理效果。我國的東北制藥廠1995年從丹麥引進(jìn)目前全國最大膜面積的平板超濾裝置后，2 - KLG的分離提純成本比原先的化學(xué)凝聚法節(jié)約了600萬元，其收率和生產(chǎn)的自動化、連續(xù)化程度也明顯提高［10］。

隨著新型膜材料技術(shù)的開發(fā)，如陶瓷膜、不銹鋼膜等的應(yīng)用，超濾法的應(yīng)用效果會有進(jìn)一步的提高。同時(shí)，國內(nèi)外正在探索反滲透、納濾等后序處理新工藝的應(yīng)用，以完善工藝聯(lián)結(jié)［11］ 。

2.2.4 其它方法

除上述三種方法外，目前還有仍處于小試階段的離子交換法和溶媒萃取法的研究報(bào)道。劉坐鎮(zhèn)等［12］用離子交換法對發(fā)酵液中2-KLG的提取工藝進(jìn)行了研究，系統(tǒng)考察了四種大孔弱堿性陰離子交換樹脂對2-KLG的靜態(tài)和動態(tài)吸附性能以及影響因素，并對洗脫條件進(jìn)行了探索。錢衛(wèi)國等［13］對溶媒萃取法的提取工藝進(jìn)行了初步研究，篩選出了較為合適的萃取劑、稀釋劑、助萃劑和反萃劑，考察了pH值、無機(jī)酸和相比對萃取性能的影響，并對三級逆流萃取過程進(jìn)行了串聯(lián)模擬。

2.3 轉(zhuǎn)化工藝

無論是萊氏法還是二步發(fā)酵法制得的2-KLG，目前在生產(chǎn)上都是通過化學(xué)反應(yīng)過程轉(zhuǎn)化為VC。根據(jù)所選試劑的不同，二步發(fā)酵法可分為酸轉(zhuǎn)化法和堿轉(zhuǎn)化法［14］。

2.3.1 酸轉(zhuǎn)化法

VC化學(xué)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，自萊氏法建立以來就采用濃鹽酸催化2-KLG ，一步制得VC。國外有關(guān)學(xué)者對此法進(jìn)行了許多研究。印度Ahmedbad Textile 工業(yè)研究協(xié)會研究表明，在以飽和氯代烴（如CHCl3）、芳烴（如苯、甲苯）為溶劑，由2-KLG 與濃鹽酸在60～75 ℃下反應(yīng)4～6 h ，可制得純度為90 %的粗VC［15］。美國學(xué)者YODICE等［16］于1985年報(bào)道了2-KLG與濃鹽酸在表面活性劑Me(CH2)5N+Me3Cl的甲苯溶液中反應(yīng)，可制得純度超過99 %的VC。近年來，關(guān)于一步酸轉(zhuǎn)化法制VC的研究報(bào)道更是層出不窮。1999 年，美國有關(guān)專利指出，在氧化鈷為催化劑的體系中，2-KLG與足量的次氯酸反應(yīng)可制得高純度的VC［17］。2000年，德國學(xué)者FECHTEL等［18］報(bào)道了2-KLG 與濃鹽酸在4. 5 Mpa的高壓釜中于42 ℃反應(yīng)3 h ，可制得VC，收率高達(dá)95 %。

酸轉(zhuǎn)化法工藝簡單，操作步驟少，但反應(yīng)過程中選用濃鹽酸對設(shè)備腐蝕嚴(yán)重。另外，由于在反應(yīng)體系中引入了惰性溶劑或表面活性劑，使后期的分離造成不便。

2.3.2 堿轉(zhuǎn)化法

我國VC 生產(chǎn)廠家均采用堿法轉(zhuǎn)化2-KLG 生產(chǎn)VC。東北制藥總廠等生產(chǎn)單位將2-KLG 與甲醇在濃硫酸催化下生成2-酮基-L-古龍酸甲酯，該酯在NaHCO3作用下發(fā)生內(nèi)酯化反應(yīng)生成VC鈉鹽。該法避免了酸催化的上述缺點(diǎn)，且操作工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，適合于規(guī)?；a(chǎn)，但是在生產(chǎn)中的反應(yīng)周期過長，甲醇單耗高［19］。有些單位嘗試用CH3ONa代替NaHCO3進(jìn)行堿轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率可高達(dá)92.6 %，但產(chǎn)品質(zhì)量較差，且甲醇鈉價(jià)格貴，造成生產(chǎn)成本較高［20］。

國外學(xué)者對堿轉(zhuǎn)化的研究也一直在進(jìn)行。Bottcher等［21］用丁醇代替甲醇，采用濃硫酸催化，在真空度0. 02 MPa 、85 ℃的條件下與2-KLG進(jìn)行反應(yīng)，2 h后蒸去多余的丁醇及生成的水，向反應(yīng)體系中加入氯乙烯和鹽酸，在72～75 ℃加熱17 h，過濾后得到純度為98 %的VC。

Veits［22］用離子交換樹脂作催化劑，使2-KLG與甲醇的反應(yīng)液于80 ℃下在樹脂柱中停留10～120 min，然后將酯化液與NaHCO3作用得到純度為98 %的粗VC鈉鹽。美國Fastman化學(xué)公司的研究人員將模擬流動床（SMB）反應(yīng)器應(yīng)用于該酯化反應(yīng)，通過SMB反應(yīng)器脫水以促進(jìn)酯化反應(yīng)的進(jìn)行［23］。Oklobdzu等［24］通過二步酯化過程促進(jìn)酯化反應(yīng)的進(jìn)行，有效地實(shí)現(xiàn)了分離反應(yīng)產(chǎn)物和反應(yīng)過程中生成的水。

由VC鈉鹽制備VC所采取的主要方法是硫酸酸化法和樹脂交換法［25］。硫酸酸化法操作簡單，但需妥善控制甲醇的濃度和pH值，才能使硫酸鈉與VC得以分離。氫型離子樹脂交換法設(shè)備龐大，操作復(fù)雜，且需經(jīng)常再生樹脂，增加了酸耗，酸液大量排放容易對環(huán)境造成威脅。目前，人們正在積極探索使用雙極性膜（Bipolar Membrane Electrodialysis，BME）來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酸化工藝［26～28］，其工作原理為：在直流電場作用下， 雙極性膜中的水被離解成H+ 和OH-， H+ 替換VC鈉鹽中的Na+ 結(jié)合成離解度小的VC，原VC鈉鹽中的Na+在電場的作用下通過陽離子交換膜從VC鈉鹽中分離出來， 并和OH-結(jié)合生成NaOH。雙極性膜電滲析法無需外加物料可將VC鈉鹽轉(zhuǎn)化成VC，過程簡單，能耗低，投資少，轉(zhuǎn)化率高，其副產(chǎn)品和NaOH稀溶液也可被有效利用，對環(huán)境無污染，有望應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。

3 葡萄糖直接發(fā)酵法

不能以葡萄糖作為直接發(fā)酵原料是二步發(fā)酵法的最大缺陷之一。以D-葡萄糖高壓加氫轉(zhuǎn)化生成D-山梨醇，不僅需要大量的能源和設(shè)備，操作上也存在很大的危險(xiǎn)性。國外較早就開始了細(xì)菌串聯(lián)發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生2-KLG的研究。Sonoyama［29］研究發(fā)現(xiàn)，歐文氏菌的突變株（Erwinia）可將D-葡萄糖氧化成為2，5-二酮基-D-葡萄糖酸，再經(jīng)棒狀桿菌屬、短桿菌屬、節(jié)桿菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬或葡萄球菌屬等其中的某些菌株還原成為2-KLG。

考慮若能將歐文氏菌和棒狀桿菌相關(guān)的特性結(jié)合于一種微生物中，構(gòu)建VC“基因工程菌”，就可實(shí)現(xiàn)從D-葡萄糖到2-KLG的一步發(fā)酵。近年來，基因工程菌的研究已成為世界上熱點(diǎn)課題之一，美國、瑞士、法國、日本等許多國家都著力開展了此方面的研究。1985年，美國Genentech公司Anderson等人［30］成功地分離純化了棒桿菌（Corynebacterium sp．）ATCC31090的2，5-DKG還原酶，并分析了該酶N-端的40個(gè)氨基酸序列，用原位雜交法從部分基因文庫中篩選到一個(gè)基因片段，再以已知片段為探針得到了完整基因，最終該基因被重組到了另一株發(fā)酵生產(chǎn)菌草生歐文氏菌（E．herbicola ATCC21998）中，得以有效表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)了從D-葡萄糖到2-KLG的一步發(fā)酵。該法的合成效率很低，只有5％左右，主要是由于合成2，5-DKG的3種關(guān)鍵酶D-葡萄糖脫氫酶、D-葡萄糖酸脫氫酶、2-酮基-D-古龍酸脫氫酶（存在于周質(zhì)中）與2，5-DKG還原酶（存在于胞質(zhì)）在細(xì)胞中所處位置的較大差異造成。后來Grindley等［31］經(jīng)過改進(jìn)，將棒桿菌的2，5-DKG還原酶的基因在E.citreus上表達(dá)，將收率提高至49％。國內(nèi)部分VC生產(chǎn)廠家以及中科院上海生物工程研究中心也在進(jìn)行此項(xiàng)課題的研究，并取得了很大的進(jìn)展。陳策實(shí)等［32］從棒狀桿菌SCB 3058中初步純化得到的2個(gè)2，5-DKG還原酶，將2，5-DKG還原酶I基因片段在大腸桿菌中得到表達(dá)。所有這些都為最終構(gòu)建基因工程菌打下了基礎(chǔ)。

由于至今尚未找到使葡萄糖直接發(fā)酵產(chǎn)生VC的微生物菌種，目前發(fā)酵產(chǎn)生的2-KLG到VC的轉(zhuǎn)化仍是通過化學(xué)方法。為了得到完整的使用細(xì)菌合成VC的生物轉(zhuǎn)化途徑，各國學(xué)者都在尋找能夠利用2-KLG合成VC的菌種。目前，Asakura等人［33］已從Zymomonas mobilis，Es- cherichia coli以及Fusarium oxysporum中分離出了內(nèi)酯化酶，可以用于2-KLG到VC的轉(zhuǎn)化，但是反應(yīng)效率極低，尚有待進(jìn)一步研究。

4 展望

VC是我國自主知識產(chǎn)權(quán)開發(fā)的首批西藥之一，也是我國最主要的出口創(chuàng)匯原料藥之一。二步發(fā)酵法是我國VC生產(chǎn)的主要工藝方法，然而該法不能直接以葡萄糖為發(fā)酵原料，且涉及二步發(fā)酵三種菌，工序繁瑣。采用基因工程等先進(jìn)技術(shù)，選育直接以葡萄糖為發(fā)酵原料的優(yōu)良菌株和優(yōu)化發(fā)酵條件將是我國VC生產(chǎn)技術(shù)研究的主要方向。

此外，目前世界上很多國家正嘗試以真核生物為研究對象，利用它們合成VC的代謝途徑開發(fā)更加環(huán)保的生物合成方法［34～36］。從我國的二步發(fā)酵法推廣后逐步取代萊氏法這一過程可以預(yù)測，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展和更具優(yōu)勢的生物合成VC方法的不斷涌現(xiàn)，生物法必將完全取代化學(xué)法在VC生產(chǎn)中的地位。為了保持我國在世界VC生產(chǎn)上的優(yōu)勢地位，必須加強(qiáng)VC生產(chǎn)的基礎(chǔ)研究工作。

參考文獻(xiàn)

1 儀宏，張華峰，曾遠(yuǎn)智，等.維生素C生產(chǎn)技術(shù)［J］.中國食品添加劑，2003，(6) :76-81.

2 劉林瑛.維生素C發(fā)酵空氣凈化系統(tǒng)工藝設(shè)計(jì)［J］.化工設(shè)計(jì)，1998，(2) :17-19.

3 焦迎暉，張惟材.維生素C發(fā)酵中伴生菌對氧化葡糖桿菌的影響［J］.微生物學(xué)通報(bào).2002，29(5):35-38．

4 馮樹，張舟，張成剛，等.混合培養(yǎng)中巨大芽孢桿菌對氧化葡萄糖酸桿菌的作用［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2000，11 (1) :119 -122.

5 劉禎.維生素C二步發(fā)酵法中優(yōu)良菌株201A的研究［J］.河北工業(yè)科技，2003，20(2):4-7.

6 陳建華，馮瑞山，郗麗萍，等. 2 -酮基- L -古龍酸產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的屬間融合［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2002 ，33 (1) :9-11，24.

7 季光輝，燕方龍，苗春，等.新型絮凝劑用于維生素C發(fā)酵液預(yù)處理［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，14 (2) :88-90.

8 陳雷，張銘錫.維生素C生產(chǎn)提取除蛋白工藝的改進(jìn)［J］.黑龍江醫(yī)藥，2001，14(6):447-448.

9 陳永林，劉梅城，翟振山.板式超濾技術(shù)在VC生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(9):136-137.

10 張林茂，高永濤，李晶.應(yīng)用超濾技術(shù)改進(jìn)VC生產(chǎn)工藝［J］.膜科學(xué)與技術(shù)，2000，20(5):60-61.

11 何旭敏，何國梅，曾碧榕，等.膜分離技術(shù)的應(yīng)用［J］.廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2001，40(2):495-502.

12 劉坐鎮(zhèn)，謝小華，徐惠珍，等.離子交換法提取α-酮基-L-古龍酸的研究［J］.華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1995，21(2):155-160.

13 錢衛(wèi)國，沈金玉，高春滿，等.溶媒萃取α-氧代-L-古龍酸的初步工藝研究［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1992，23(6)：247-250，246.

14 李春艷，夏海平，藍(lán)偉光.維生素C生產(chǎn)工藝進(jìn)展［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2001，32(1):38-40.

15 Ahmedbad Textile Industry Research Assoc. Synthesis of Ascorbic Acid from 2 ，3 ，4 ，6-di-σ-isopropylidene-2-keto-L-gulonic Acid Monohydrate［P］.IN .149287.1981-10-17.

16 YODICE R. Production of L-ascorbic from 2-keto-L-gulonic Acid［P］.US .764246 .1985208209.

17 MURPHY A P ，HEN THOME L R. Process and Catalyst s fora One-step Synthesis of Vitamin C［P］.US .5998634.1999-12-07.

18 FECHTEL U，HEINZ W，MULL ER B，et al . Production of L-ascorbic Acid［P］.DE.19904821.2000-07-06.

19 燕方龍，趙愛群.抗壞血酸合成中酯化工藝研究［J］.遼寧化工，1995，(6):54-56.

20 西安制藥廠中心實(shí)驗(yàn)室.改進(jìn)維生素丙轉(zhuǎn)化工藝:甲酯-甲醇鈉法［J］.醫(yī)藥工業(yè)，1980，11(9):28.

21 BOTTCHER A，CURSKI H，KUNTZE T. Manufact ure of L-ascorbic Acid［P］.EP.1048663.2000-11-02.

22 VEITS J. Manufacture of 2-keto-gulonic Acid Esters［P］.US.5744634，1995-09-13.

23 BHASKAR K A， STEVEN T P. Process for Preparation of Ascorbic Acid［P］.US.6476239.2002-11-05.

24 OKLOBDZU A M，HOHNJ EC M. Improved Method for Production Ascorbate by Reducing Water Cotent of Reaction Mixture［P］.WO.9903853.1999-01-28.

25 謝占武，周海霞，曹愛國.維生素C的生產(chǎn)工藝發(fā)展［J］.實(shí)用藥物與臨床，2005，(8):1-2.

26 林愛光，蔣維鈞，余立新.雙極性膜電滲析技術(shù)在維生素生產(chǎn)中的應(yīng)用研究［J］.膜科學(xué)與技術(shù)，1998，18(5):24-27.

27 XU A，YAO J，YU L，et al . Mutation of gluconobacter oxydans and bacillus megaterium in a two-step process of L-ascorbic acid manufacture by ion beam［J］.Journal of Applied Microbiology ，2004 ，96(6):1317-1323.

28 蘇保仲.雙極膜技術(shù)在VC生產(chǎn)中的應(yīng)用條件［J］.中國科技信息，2005，(16A):7.

29 Sonoyama T， Tani H， Matsuda K， et al.Production of 2-keto-L-gulonic from D-glucose by two-stage fermentatin［J］.Appl Environ Microbiol，1982，(43):1064-1069.

30 Anderson S，Mark C，Lazarics R，et a1.Production of 2-keto-L-gulonate.an intermediate in L-ascorbate synthesis，by a genetically modified Erwinia herbicola［J］.Science，1985，(230):144． 

31 Grindley J F，Payton M A，Van De Pot H，et a1.Conversion of g1ueose to 2-keto-L-guionate， an intermediate in L-ascorbate synthesis，by a recombinant strain of Emvinia citreus［J］.App1.Environ.Micobio1.1988，(54):1770-1775．

32 陳策實(shí)，尹光琳.棒狀桿菌2，5-二酮基-D-葡萄糖還原酶I基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)［J］.微生物學(xué)報(bào)，1998，38(6):435-440．

33 Asakura，A.Manufacture of L-ascorbic acid and D-erythorbic acid［P］.EP.1026257.2000.

34 Jain，A.K.，Nessler，C.L.Metabolic engineering of an alternative pathway for ascorbic acid biosynthesis in plants［J］.Mo1.Breed，2000，(6):73-78．

35 Hancock.R.D.，R.Viola.Biotechnological approaches for L-ascorbic acid production［J］.Trends Biotechnol，2002，(20):299-305．

36 Michanl Saner.Paola Branduardi.Minoska Valli，et a1.Production of L-Ascorbic Acid by Metabolically Engineered Saccharomyces cerevisiae and Zygosaccharomyces bailii［J］.Applied and Environmental Microbiology，2004，70(10):6086-6091．

(收稿日期：2007-10-15)