ＲＰ－ＨＰＬＣ測定內(nèi)消瘰疬片中柚皮苷的含量

摘 要:目的：測定內(nèi)消瘰疬片中柚皮苷的含量。方法：高效液相色譜法。Alltech C18色譜柱， 乙腈-水(0.2%磷酸)溶液(23:77)；檢測波長為283nm。結(jié)果：柚皮苷在0.052～0.52 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.9997)。平均回收率99.79%(n=6，RSD=1.52%)。結(jié)論：操作簡便、結(jié)果準確，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：內(nèi)消瘰疬片；RP-HPLC；柚皮苷

中圖分類號：R284.1文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2007）24-032-02

內(nèi)消瘰疬片是由夏枯草、玄參等17味中藥組成的片劑，具有軟堅散結(jié)的功效^[1]。現(xiàn)代研究表明，枳殼中主要含有黃酮、少量生物堿及揮發(fā)油三大類成分，其中最能體現(xiàn)枳殼特征的成分是黃酮類成分中的柚皮苷相對含量比較高，藥理活性較強，文獻報道有TLC-UV^[2]、HPLC^[3]測定枳殼中柚皮苷含量的方法。

1 儀器、試藥與樣品

1.1 儀器

waters 2695高效液相色譜儀。BP211D型電子天平(十萬分之一，德國Sartorius公司);KQ-500E型超聲波清洗(昆山市超聲儀器有限公司);Milli-Q超純水(Millipore，法國);watreman0.45μm濾膜。

1.2 試劑

乙腈（色譜純，fisher公司），磷酸（分析純，北京化工廠），超純水（Milli Q 超純水，過0.2μm微孔濾膜）。

1.3 樣品

市售內(nèi)消瘰疬片。

1.4 對照品

柚皮苷對照品（中國藥品生物制品檢定所購置，批號：110722-200309，供含量測定用）。

2 含量測定

2.1 色譜條件

色譜柱: Allsphere ODS-25u (4.6×250mm)，柱溫:25°C。流動相為乙腈-水(0.2%磷酸)溶液(23∶77)；檢測波長為283nm；流速：1ml/min。

2.2 對照品溶液的制備

取柚皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含26μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品適量，研細，取約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50％乙醇25ml，密塞，稱重，超聲處理60分鐘，放至室溫，再稱定重量，必要時用50％乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5ml，置10ml量瓶中，加50％乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.4 陰性對照試驗

用除枳殼藥材外的其它藥材的處方量，照工藝要求制備陰性對照品，按質(zhì)量標準正文中含量測定項下進行高效液相色譜試驗，所得陰性對照色譜圖中，在內(nèi)消瘰疬片色譜圖中柚皮苷峰的出峰位置上未出現(xiàn)吸收峰，表明處方中其它藥材對柚皮苷含量測定無影響(見圖1~3)。

2.5 線性關(guān)系的考察

精密吸取濃度為26μg/ml的柚皮苷對照品溶液2，5，8，10，15，20μl，注入液相色譜儀，按“2.1”色譜條件分析，測定各自峰面積，以對照品進樣量（μg）為橫坐標，峰面積值為縱坐標，求得回歸方程：y=2044452.89x-2215.09，r=0.9997。結(jié)果表明柚皮苷在0.052～0.52μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗

取內(nèi)消瘰疬片供試品溶液10μL，重復(fù)進樣6次，測定峰面積RSD為1.29%，表明精密度合格。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取內(nèi)消瘰疬片供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24小時各進樣10μL，測定柚皮苷峰面積RSD為1.97%。結(jié)果表明:樣品在24h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

取內(nèi)消瘰疬片樣品（同一批號），共6份，研細，取約1g，按照供試品溶液制備操作，按“2.1”色譜條件分析，測定每份樣品中柚皮苷含量。結(jié)果樣品中柚皮苷平均含量為1.618mg/g，RSD為1.55％，符合要求。

2.9 柚皮苷回收率試驗

取同一批號樣品，研細，取約0.5g，共6份，精密稱定，分別精密加入對照品儲備液(濃度0.032mg/ml)各25ml，再按照“2.3”供試品溶液制備操作，制得供試品溶液，按“2.1”色譜條件分析，計算回收率，結(jié)果平均回收率為99.79％，RSD為1.52％。結(jié)果見表1。

測定結(jié)果提示:本方法回收率在98.29%~102.53%之間，RSD為1.52%。

2．10 耐用性試驗

2.10.1 不同色譜柱的耐用性

按“2.1”色譜條件，使用Agilent HC-C18柱 5μm (4.6mm×250mm)對內(nèi)消瘰疬片供試品溶液進行分離，測試結(jié)果柚皮苷可以與相鄰的組分分離，說明柱子的耐用性好。

2.10.2 不同儀器的耐用性

按“2.1”色譜條件，用Allsphere ODS-2 5u柱 5μm (4.6mm×250mm)，采用waters 2695高效液相色譜儀對內(nèi)消瘰疬片供試品溶液進行分離，測試結(jié)果柚皮苷可以與相鄰的組分分離，說明儀器的耐用性好。

2.11 樣品含量測定

分別取三個批號內(nèi)消瘰疬片樣品，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液10μL，供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測定峰面積，計算內(nèi)消瘰疬片中柚皮苷的含量。結(jié)果見表2。

3 討論

供試品提取方法的選擇：提取溶劑為70％乙醇，采用加熱回流方式，提取時間為1小時所測結(jié)果，和超聲處理方式提取1小時結(jié)果無顯著差別，超聲提取操作較為簡便，故采用超聲提取的方法。提取溶劑的選擇：本實驗使用了50%乙醇、70%乙醇、90％乙醇三種溶媒提取，結(jié)果顯示，提取溶劑為50%乙醇，測得的樣品含量高于其它兩種溶劑，故采用50%乙醇為提取溶劑。提取時間的選擇：本實驗考察了超聲處理30分鐘、60分鐘、90分鐘，結(jié)果提取60分鐘已將樣品中柚皮苷提取完全，故將提取時間定為60分鐘。流動相的選擇：參考《中國藥典》2005年版枳殼^[4]項的流動相及文獻^[2，3]報道流動相，進行試驗，反復(fù)摸索，考察了甲醇-水系統(tǒng)，乙腈-水系統(tǒng)，甲醇-磷酸鹽緩沖液系統(tǒng)，最終選定乙腈-水(0.2%磷酸)溶液(23:77)系統(tǒng)，樣品中柚皮苷峰形較好，與其它組分均可達到基線分離，空白對照亦無干擾。本實驗結(jié)果表明，用本文HPLC法測定內(nèi)消瘰疬片中柚皮苷的含量，方法靈敏度高、專屬性強、重現(xiàn)性好，可有效控制內(nèi)消瘰疬片質(zhì)量。

參考文獻：

［1］ 中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準.中藥成方制劑［S］.第十五冊，34.

［2］ 楊書斌，王琦，張典瑞.薄層層析—分光光度法測定枳殼中的橙皮苷和柚皮苷［J］.中國中藥雜志，1994，19(6):359.

［3］ 江波，石典花，袁振海.HPLC測定枳殼飲片中柚皮苷的含量［J］.中國現(xiàn)代中藥，2007，9（3）：12.

［4］ 國家藥典委員會編.中國藥典（Ⅰ部）［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.171.

Determination of the Content of Naringin in Neixiao Luoli Pian by HPLC

Abstract: Objective:To determine the content of Naringin in Neixiao Luoli Pian. Method:It was assayed by HPLC. The column was Alltech C18， the mobile phase was acetonitril-water（0.2%orthophosphoric acid）(23:77). The UV detection wavelength was 283nm. Results:There was a good liner relationship within the concentration range of 0.052～0.52μg of Naringin (r=0.9997).The average recovery was 99.79%(n=6，RSD=1.52%). Conclusion:Results obtained showed that its a reliable and accurate method for the quality control of Neixiao Luoli Pian.

Key word:Neixiao Luoli Pian; HPLC ; Naringin