ＲＮＡ干涉技術在基礎醫學中的研究進展

摘 要：RNA干涉(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)引起的轉錄后基因沉默機制，具有序列特異性和高效性，RNAi作為一門新的基因阻斷技術，在基礎醫學研究及基因治療中具有廣闊的應用前景。對RNAi作用機制及其在疾病發病機制及治療方面的研究進展進行了概述。

關鍵詞：RNA干涉；基因阻斷技術；基因沉默

中圖分類號：R318文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2008）02-032-03

RNA干涉(RNA interference，RNAi)是近年來發展起來的新技術，被《Science》雜志評為2002年度十大科技之首，《Nature》雜志亦將其評為2002 年度最重要科技發現之一。RNA干涉是指人為地引入與靶基因具有同源序列的雙鏈RNA(dsRNA)，通過正義RNA與反義RNA形成互補雙鏈RNA，誘導內源目的基因的mRNA降解，特異性地抑制目的基因的轉錄后翻譯，從而達到阻止表達的目的。

隨著人們對RNA 干涉機制認識的不斷深入，RNA干涉技術將不斷完善并應用到更為廣闊的領域，為人類揭示生物界基因組功能的奧秘作出貢獻，同時為人們探索疾病的發病機制及基因治療提供新的思路。

1 RNA干涉的機制

通過對RNAi現象的遺傳學與生物化學研究，其作用機制已日漸清晰(見圖1)。Zamore 等利用果蠅胚胎提取物建立的體外系統， 證實RNAi是一個依賴ATP的過程， 在此過程中， dsRNA(外源的或體內產生的)首先被降解為具5-單磷酸、長21～23bp的小分子雙鏈RNA，這種RNA分子被稱為小干擾RNA（siRNA），siRNA通過堿基互補配對識別具同源序列的mRNA，并介導其降解。研究表明，在生物體中siRNA具相似的結構特征，為長約21～23bp的雙鏈RNA，具5-單磷酸和3-羥基末端，互補雙鏈的3端均有一個2～3nt 的單鏈突出。 

在RNAi過程中，一種被稱為Dicer的核酸酶負責將dsRNA轉化為siRNA，它屬于RNaseⅢ家族，具有兩個催化結構域、一個解旋酶(helicase)結構域和一個PAZ (Piwi/ Argonaute/ Zwille)結構域，Dicer在催化過程中以二聚體的形式出現，其催化結構域在dsRNA上反平行排列，形成四個活性位點，但只有兩側的兩個位點有內切核酸酶活性，這兩個位點在相距約22bp的距離切斷dsRNA，各種生物體內Dicer結構略有不同，致使siRNA長度存在微小差別。siRNA形成之后，與一系列特異性蛋白結合形成siRNA誘導干擾復合體(siRNA-induced interference complex，RISC)，此復合物通過堿基互補配對識別靶mRNA并使其降解，從而導致特定基因沉默。在RISC中，起靶序列識別作用的是siRNA的反義鏈，Zamore等發現在RNAi過程中，首先產生的是RISC無活性前體，分子量約為250kD，當加入ATP后可形成100kD 的活性復合體。由無活性前體向活性酶復合物的轉換類似蛋白酶原的激活， 但RISC 酶復合物激活不需要共價鍵斷裂， 而要求結合于其上的siRNA 雙鏈的解開。在ATP存在時，依賴于ATP的解旋酶解開siRNA的雙鏈并將其正義鏈與靶mRNA置換，mRNA取代正義鏈與反義鏈互補，然后由活化的RISC 在互補區的中間，距siRNA反義鏈3末端約12bp處切斷靶mRNA序列。RNAi效應具有兩個明顯的特征：特異性和高效性。干擾的高效性提示在機制中存在信號放大的步驟。Fire等早在1998年便發現少量的dsRNA就能夠導致線蟲大量的靶mRNA 降解，但單憑少量dsRNA被Dicer降解為幾十個siRNA并不能解釋這種高效性。許多研究顯示，RNAi過程中有新的dsRNA分子的合成，當siRNA反義鏈識別并結合靶mRNA后，siRNA反義鏈可作為引物，以靶mRNA為模板，在依賴于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)催化下合成新的dsRNA，然后由Dicer切割產生新的siRNA，新siRNA再去識別新一組mRNA，又產生新的siRNA，經過若干次合成—切割循環，沉默信號就會不斷放大(圖1)。正是這種稱為靶序列指導的擴增(target-directed amplification)機制賦予了RNAi的高效性和持久性。

2 RNAi技術在基礎醫學方面的研究

2.1 在腫瘤治療研究方面

癌基因的激活和過度表達是許多腫瘤發病的重要原因。基因治療在腫瘤的防治研究中一直十分令人關注。我國學者在世界上率先嘗試利用核酸干擾技術來治療乳腺癌：通過人工模擬合成針對hdm2基因(引起乳腺癌的重要基因)的dsRNA(hdm2-siRNA)，導入已患人乳腺癌的裸鼠體內，發現可以明顯抑制hdm2的表達，使hdm2基因沉默，抑制Bcl22、NF2kB以及Ras等癌基因的表達，激活細胞內的抑癌基因P53、P21、BRCA1和Bax等抑癌基因的表達，使抑癌基因的蛋白表達顯著增強，引起腫瘤細胞的凋亡，并引起一系列與腫瘤生長相關信號的傳導反應，抑制乳腺癌的生長。他們還發現， hdm2-siRNA 具有活體內的抗腫瘤活性，能促使乳腺癌臨床治療藥物絲裂酶素(mitomycin) 更有效地殺死乳腺癌細胞，提高抗癌效果。因此，hdm 2-siRNA 可能成為一種治療人乳腺癌和其它腫瘤的有廣闊前景的基因特異性藥物。

2.2 RNA干涉技術在病毒性疾病治療方面

2001年，Tuschl研究組的突破性研究開創了RNAi技術治療人類疾病的新途徑，dsRNA迅速成為治療HIV的新武器。美國費城的Thomas Jefferson大學生化及分子藥理研究所RogerJ.Pomerantz博士指出，將這項新穎的技術應用于人類疾病的治療上可能有莫大的潛力。Bitko 等應用siRNA成功抑制了呼吸道合胞病毒(RSV)基因的表達，為防止RSV感染開創了新的途徑。Lee和Coburn等分別報道了使用帶有原病毒DNA 及siRNA 的表達載體共轉染被HIV 感染的細胞株，結果顯示能有效抑制HIV基因的轉錄。人們利用RNAi技術成功地控制了HIV在細胞內的復制能力，然而，將該項技術用于臨床治療尚有一定距離。首先，dsRNA 轉染到原代T淋巴細胞比較困難，是anti-HIV dsRNA 在臨床應用上的一大障礙。其次，RNAi具有高度特異性，靶序列上一個堿基的差異即可導致抑制效果明顯不同，而HIV逆轉錄酶的錯配率較高(每個復制周期可達1/1000nt)，可能會迅速產生病毒突變株逃避dsRNA的抑制作用。再者，不同個體甚至同一個體內的HIV 病毒基因組呈現的序列復雜多樣，給dsRNA的設計帶來困難。

2.3 在生物制藥方面

思路是根據病原體如病毒、細菌等的致病基因序列， 以及生物體內與疾病發生相關的基因序列， 設計和制備與這些基因序列有同源序列的dsRNA， 轉入動植物內，使有關的疾病基因沉默， 從而達到治療效果。Acuity制藥公司利用RNAi技術開發的治療老年性黃斑的藥物即將進入臨床試驗， 正在等待FDA 批準。但是RNAi技術尚有許多亟待解決的問題， 如篩選出針對致病蛋白質而不影響細胞正常新陳代謝的siRNA 等。

2.4 在治療其它疾病方面

除了H IV、HBV、HCV以外，科研人員還開展了許多其它疾病的RNAi研究。約翰#8226;霍普金斯大學的David等研究人員通過引入RNAi技術發現了膽紅素強大的抗氧化作用，有可能替代谷胱甘肽成為治療新一代幾乎所有因氧化脅迫而導致的細胞損傷和死亡的方法。愛達荷大學的研究小組通過siRNA降低了多谷氨酸鏈延伸疾病，包括脊髓小腦共濟失調(spinocerebel-laratacias)和亨廷頓氏舞蹈病等，它們都是由多谷氨酸鏈的延伸增加引起的。美國西北大學的Carthew和日本基因研究所的Ishizuka等人幾乎在同一時間發現了RNAi同脆性X染色體綜合征，與FMR-1基因異常有關的導致智力低下的染色體病之間的關系密切，揭示了與RNAi相關機制的缺陷可能導致人類疾病的病理機制，成為當今研究RNAi的又一大熱點。

3 展望

RNA干涉作為真核生物抵御外來基因和抗病毒感染的一種保守機制廣泛存在，經人們認識后，正逐漸成為研究基因功能和潛在的治療臨床多種疾病的有力手段。應用RNA干涉技術，有助于對難治性疾病發病機制的認識，更為多種病毒性疾病和腫瘤等醫學頑癥的根治，開辟了一條新的有效的途徑。因此，RNAi的研究與應用，具有極其重要的理論和實際意義，它將對醫學生物學的發展產生深遠的影響。

參考文獻：

［1］ Zamore PD，Tuschl T， Sharp PA.RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals［J］. Cell， 2000， 101(1): 25-33.

［2］ Sharp PA.RNA interference-2001［J］. Genes Dev，2001，15(5): 48-2490.

［3］ Hannon GJ.RNA interference［J］.Nature，2002，418(6894): 244-251.

［4］ Hammond SM，Bernstein E， Beach D.An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells［J］.Nature，2000，404(6775):293-296.

［5］ Nykanen A，Haley B，Zamore PD. ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway［J］. Cell， 2001， 107(3): 309-321.

［6］ Fire A，Xu SQ，Montgomery MK.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in C［J］.elegans. Nature， 1998， 391(6669): 806-811.

［7］ 馬鵬鵬，薛社普，韓代書. RNA干擾技術的原理與應用［J］.中國組織化學與細胞化學，2003，12(2)，201-207.

［8］ Liu TG， Yin JQ， Shang BY. Silencing of hdm 2 oncogene by siRNA inhibits p53-dependent human breast cancer［J］. Cancer Gene Therapy， 2004， 11(11): 748-756.

［9］ 王長印，董振芳，宋曉斐.RNA干擾技術及其在臨床醫學中的應用進展［J］.山東醫藥，2005，45（5）:69-72.

［10］ Lee M T，Coburn G A，McClure M O. Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in primary macrophages by using Tat or CCRS-specific small interfering RNAs expressed from a lentivirus vector ［J］. JIlrol，2003，77(22):119641.

［11］ 石玉濤，馬玉珍.RNA干涉技術在臨床醫學中的研究進展［J］.內蒙古醫學(Inner Mongolia Med J)，2006，38（6）:537-541.

［12］ 涂知明， 方華舟， 杜紅.RNA干擾技術(RNAi)在醫學上的應用研究［J］. 中國優生與遺傳，2007，15（4）:1-3.

［13］ David E，MahilRao，Christopher D， Terris. Biliverdin reductase； Amajor physiologic cytoprotetant ［J］. Proc NatI Acad Sci，2002（25）: 16093-16098.

［14］ Carthew R W. RNA interference: the fragile X syndrome connection［J］. Curr Boil，2002，12(24): 852-854.

［15］ Ishizuka A， SiomiMC， Siomi H. A drosophila fratile X protein interacts with components of RNA and ribosomal proteins ［J］. GenesDev， 2002， 16(19): 2497-2508.

［16］ 許小亮，李君武.RNAi技術在臨床中的運用［J］.廣東藥學院學報，2005，21(1):77-81.

［17］ 劉海防，謝青.RNA干擾抗艾滋病病毒感染研究進展［J］.國外醫學#8226;流行病學傳染病學分冊，2005，32(3):162-165.

［18］ 董倫.RNA干擾技術在腫瘤基因治療研究中的應用［J］.國外醫學腫瘤學分冊，2004，31(3):172-177.

［19］ 井長勤，張秀華，劉涌濤.RNA 干涉技術研究進展［J］.安徽農業科學，2007，35(13):3780-3781.

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(責任編輯：杜 靖)

Study Progress of RNA Interference in Preclinical Medicinel Research

YangAnan

(The First Team of Pharmacy Department，The Fourth Military Medical University，Xian 710032，China)

Abstract:RNA interference (RNAi) is a phenomenon by which the double stranded RNA (dsRNA) induces targeted degradation of RNA molecules with homologous sequences in vitro and in vivo. It has some features such as specific，efficient and quick etc. RNAi is a new tool for silencing gene expression. RNAi is currently used for both clinic medical study and gene specific therapeutic intervention that target the mRNAs of pathogenic genes. Here the mechanism and application of RNAi are reviewed.

Key words: RNA interference； Gene silence； Etiological treatment