ＨＰＬＣ法測(cè)定銀杏緩釋片中總黃酮苷的含量

摘 要:目的：建立測(cè)定銀杏緩釋片中總黃酮苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，用DiamonsilTM-0DS柱，以甲醇-0.5%磷酸(52∶48)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)360nm，流速1ml/min，保持柱溫40℃測(cè)定自制銀杏緩釋片中總黃酮苷的含量。結(jié)果：槲皮素在5～60μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率為99.7%，RSD為0.93%。結(jié)論：本法測(cè)定銀杏緩釋片中總黃酮苷的含量，結(jié)果準(zhǔn)確、可行。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；銀杏緩釋片；銀杏葉提取物；總黃酮苷

中圖分類號(hào)：R282.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1673-2197（2008）02-045-03

銀杏（Ginkgo biloba）是最古老的中生代植物，至今已有20億年的歷史，現(xiàn)僅存一科一屬一種，素有裸子植物“活化石”之稱。銀杏很早就被用作中藥，其種子、根、葉均可入藥。《本草品匯精要》中記載銀杏葉“味甘、澀、性平、歸肺經(jīng)，能斂肺平喘、益心止痛、化濕止瀉”。

銀杏葉提取物（Ginkgo Biloba Extract，GBE）具有降低血清膽固醇、增加胃狀動(dòng)脈血流量、改善心血管循環(huán)、解除平滑肌痙攣、松弛支氣管和抗菌、抗病毒、抗癌等作用，其在動(dòng)脈血管和腦血管疾病方面的療效已被臨床試驗(yàn)證明［7］。盡管目前已從銀杏葉中分離出30多個(gè)化學(xué)成分，但臨床藥用的主要化學(xué)活性成分份仍為黃酮類（包括黃酮、黃酮醇及其苷、雙黃酮、兒茶素類等）和萜類內(nèi)酯（包括銀杏內(nèi)酯A、B、C、J、M和白果內(nèi)酯等）。藥理實(shí)驗(yàn)表明，銀杏內(nèi)酯是血小板活化因子的拮抗劑，銀杏黃酮類成分在抗氧化和心血管疾病等方面療效顯著［1，2］。

目前，國(guó)際上銀杏葉提取物及其制劑沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，也沒(méi)有統(tǒng)一的測(cè)定方法。通用的標(biāo)準(zhǔn)是總黃酮苷含量不得少于24.0%，萜類內(nèi)酯含量不得少于6.0%。國(guó)內(nèi)外研究資料在評(píng)價(jià)銀杏制劑的體內(nèi)、外行為時(shí)，大多是以總黃酮苷作為指標(biāo)的，故本文也采用銀杏黃酮作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。其中，槲皮素、山柰酚和異鼠李素是銀杏黃酮的重要組成成分，它們都含有多個(gè)羥基，主要以與葡萄糖、鼠李糖等結(jié)合成糖苷的形式存在。但銀杏葉提取物口服時(shí)生物半衰期短，絕對(duì)生物利用度偏低，易造成血濃峰谷波動(dòng)現(xiàn)象，而且病人的順應(yīng)性差，療效不穩(wěn)定。本文對(duì)其進(jìn)行了劑型改進(jìn)，制成緩釋片后，既能保證療效，又便于病人服用。并且建立了測(cè)定銀杏緩釋片中總黃酮苷含量的方法，用于本品質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Dionex P680 HPLC Pump，Dionex UVD170U；色譜柱：DiamonsilTM-0DS(4.6mm×250mm，5μm)；KQ-100型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；銀杏緩釋片（規(guī)格：45mg/片，自制）；槲皮素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；山柰素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；異鼠李素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；HPMC（廣州化學(xué)試劑廠）；丙烯酸樹(shù)脂L30D-55（德國(guó)羅姆）；微晶纖維素（廣州市東興精細(xì)化工有限公司）；甲醇（色譜純，依能色譜有限公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 銀杏緩釋片的制備

按處方比例將銀杏葉提取物與丙烯酸樹(shù)脂、乳糖、HPMCK100M 混勻后，其它輔料過(guò)篩、混合均勻，加入5%PVP乙醇液適量制軟材，過(guò)16目篩制濕顆粒，于40℃左右烘干，20目篩整粒，加入硬脂酸鎂適量，混合均勻后備用。將所得顆粒用9mm淺弧沖壓制成片劑，每片含銀杏提取物45mg。

2.2 含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱：DiamonsilTM-0DS(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.5%磷酸(52∶48)；流速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥24h的槲皮素、山柰素、異鼠李素對(duì)照品，各加甲醇制成200μg/ml、100μg /ml、50μg/ml的儲(chǔ)備液。以流動(dòng)相為稀釋液配成每1ml分別含4μg槲皮素、4μg山柰素、1μg異鼠李素的混合液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

取本品10片，研細(xì)，精密稱取相當(dāng)于銀杏葉提取物50mg的粉末適量于50ml容量瓶中，加甲醇至刻度，超聲處理20min，濾過(guò)，棄去初濾液，精密吸取續(xù)濾液4ml，置燒瓶中，加入36ml甲醇、10ml25%鹽酸溶液，搖勻，置80℃水浴中加熱回流30min，迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。

2.2.4 專屬性

按處方比例稱取空白輔料適量，以流動(dòng)相超聲溶解配制成溶液，過(guò)濾，取續(xù)濾液為空白輔料溶液；將該溶液20μl進(jìn)樣，記錄色譜圖(見(jiàn)圖1)。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥24h的槲皮素對(duì)照品10mg于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL于20mL容量瓶中，以動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，分別精取續(xù)濾液20μL進(jìn)樣，記錄色譜圖(見(jiàn)圖2)，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=0.9714C-0.9095(r=0.9998)，結(jié)果表明，槲皮素在5～60μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 回收率試驗(yàn) 

采用加樣回收法，取銀杏緩釋片適量，精密稱定，置于50ml容量瓶中，加甲醇適量，待溶化后，精密加入對(duì)照品溶液8ml、10ml和12ml（即槲皮素32、40和48μg）各3份，以流動(dòng)相稀釋至刻度。其總濃度分別對(duì)應(yīng)于測(cè)定濃度的80%、100%和120%水平，用0.45μm濾膜濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液20μl，注入色譜儀，記錄色譜圖，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算槲皮素的量并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.7 精密度

取對(duì)照品溶液，分別在0、2、4、6、8小時(shí)，連續(xù)5天測(cè)定其峰面積。結(jié)果槲皮素、山柰素、異鼠李素的日內(nèi)及日間精密度分別為RSD＝0.36%、0.48%、0.54%和1.3%、1.7%、1.2%。 

2.2.8 樣品含量測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，分別計(jì)算槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量，按下式換算成總黃酮苷的含量。

總黃酮苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+異鼠李素含量)×2.51

按前述方法HPLC測(cè)定銀杏葉提取物緩釋片3批，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

現(xiàn)已開(kāi)發(fā)的銀杏制劑有片劑、膠囊劑、注射劑、顆粒劑、口服液、滴劑、軟膏、氣霧劑、霜?jiǎng)┑榷喾N劑型［3］，如德國(guó)Schwabe制藥公司的TEBONIN（金納多）和法國(guó)博福-異普生（Beaufour-Ipsen）制藥公司的TANAKAN（達(dá)那康）、浙江康恩貝的天保寧、深圳海王藥業(yè)的銀可絡(luò)、三九集團(tuán)立華制藥的999銀杏葉片、河北遵化制藥廠的銀杏口服液、山西心研所的銀杏膠囊等等。但由于其適應(yīng)癥腦血管病為慢性疾病，恢復(fù)期和后遺癥期周期長(zhǎng)，易造成血濃峰谷波動(dòng)現(xiàn)象，而且病人的順應(yīng)性差，同時(shí)存在易漏服和夜間服藥間隔時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而不能維持有效血濃和發(fā)揮持續(xù)治療效果的缺點(diǎn)，易出現(xiàn)療效上的盲區(qū)。制成緩釋片后，不僅可以減少服藥次數(shù)，使用藥更加方便，同時(shí)可使藥物在體內(nèi)緩慢釋放，維持體內(nèi)血濃的穩(wěn)定，解決了普通制劑“峰谷”血濃變化大，以及由于夜間服藥間隔長(zhǎng)而存在治療盲區(qū)的隱患。

目前，體外對(duì)黃酮類物質(zhì)的測(cè)定一般有比色法、紫外分光光度法、HPLC法、薄層掃描法，其中比色法和紫外分光光度法的專屬性較差，誤差較大，而HPLC法是先使用水解法將黃酮苷水解為黃酮苷元再進(jìn)行HPLC分析，分別用槲皮素、山奈酚、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品外標(biāo)法測(cè)定苷元含量總和再乘轉(zhuǎn)化因子計(jì)算出黃酮苷的含量，效果較好［4］。本文采用HPLC法測(cè)定緩釋片含量，以銀杏總黃酮苷作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，其含量不得低于銀杏提取物總量的24%。最終含量測(cè)定結(jié)果按槲皮素峰計(jì)算，理論塔板數(shù)高于2500，山柰素峰與異鼠李素峰的分離度應(yīng)大于1.5，3批樣品的平均含量為11.714mg，占銀杏提取物總量的26.0%，達(dá)到了評(píng)價(jià)指標(biāo)的要求。本法測(cè)定銀杏緩釋片的含量，不需繁雜的前處理，提高了效率，方法簡(jiǎn)單易操作，可作為銀杏緩釋片的質(zhì)量控制方法。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 陳仲良.銀杏提取物的化學(xué)成分和制劑質(zhì)量［J］.中國(guó)藥學(xué)，1996，31（6）：326.

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［3］ 馬盼香，方成根，連渝平.銀杏葉制劑的研究與現(xiàn)狀［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合，2003，12(22)：2486-2487.

［4］ 黃燕萍.國(guó)內(nèi)銀杏的研究概況［J］.基層中藥，2000，14（4）：48-50.

(責(zé)任編輯：杜 靖)

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RP-HPLC Method for the Determination of Total Flavonoid Glycoside in 

Ginkgo Biloba Sustained-release Tablets

Tan Peihan

(Guang Dong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006， China)

Abstract:Objective:To establish assaying methods for the determination of total flavonoid glycoside in Ginkgo biloba sustained-release tablets.Method: External standard method was conducted with the column of C18 (250×4.6 mm，5?m)， mobile phase of methanol-0.5% orthophosphoric acid (52:48)， flow rate of 1.0ml/min， and detection wavelength was at wavelength of 360nm.Results: In the range of 5～60μg，the distribution of quercetin is linear (r=0.9998)， with an average recovery of 99.7%±1.3% (RSD=0.93%).Conclusion: The assaying method of RP-HPLC is convenient， accurate， and reliable with good precision， and can be used in the quality control of Ginkgo biloba sustained-release tablets.

Key words:RP-HPLC; Ginkgo biloba sustained-release tablets; Total flavonoid glycoside