ＶＥＧＦ明膠緩釋微球對大鼠背部隨意皮瓣存活的影響

[摘要]目的：研究局部注射血管內皮生長因子(VEGF)復合明膠微球對SD大鼠背部隨意皮瓣存活的影響。方法: 采用改良的乳化冷凝法交聯制備復合VEGF 的明膠緩釋微球，將其注射于大鼠背部隨意皮瓣，24只SD大鼠隨機分為復合VEGF微球組（A組）、VEGF治療組（B組）和對照組（C組），術后7天分別進行皮瓣存活率、新生血管計數的檢測。結果：術后7天皮瓣的存活率分別為(68.54±2.79)%，(58.65±3.26)%，（45.43±2.71）%，治療組存活率顯著高于對照組（P＜0.05），且存活質量A組最好；皮瓣內新生血管計數分別為(31.16±4.38)，(25.41±4.06)，(18.68±5.44)具有顯著差異性。結論:VEGF緩釋微球可以促進缺血皮瓣的血管新生，提升皮瓣存活率。

[關鍵詞]血管內皮生長因子；微球；明膠；緩釋；隨意皮瓣；存活

[中圖分類號]R622[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）05-04

The efect of VEGF-impregnated microsphere system on random dorsal skin flap survival in rat

WANG Lu，GUO Shu-zhong，MA Xian-jie，SONG Bao-qiang，WU Shang-min，YI Cheng-gang

(Institute of Plastic Surgery of People's Liberation Army， Xijing Hospitol，the Fourth Military Medical University，Xian 710032)

Abstract: ObjectiveTo study the effect of VEGF sustained release microsphere system on survival of the ischemic skin flap in rats．MethodsThe VEGF - impregnated microsphere was prepared by emulsified cold -condensation method and twenty-four SD rats were randomized into three groups with 8 rats each. An ischemic skin flap s of 8 cm ×2 cm were designed on the back. Rats received subdermal injection of the VEGF - impregnated microsphere ( group A) ， VEGF (group B) and saline(group C). The survival rate of the flap and the number of the new bloods vessels were determined on the 7th day after operation. ResultsThe flap survival rate were(68.54±2.79)%， (58.65±3.26) %， (45.43±2.71)%respectively，with significant between any 2 group( all P＜0.05) and the survival quality of the group A was the best. And the number of the new blood vessels were(31.16±4.38)，(25.41±4.06)，(18.68±5.44)respectively.there was significant difference statistically.CondusionThe VEGF - impregnated microsphere can increases the neovascularization in ischemic skin flaps and augments their survival rate.

Key words: vascular endothelial grouth factors(VEGF);microsphere，gelatin;sustained-release;random pattern flap;survial

應用皮瓣進行創面修復、功能重建及外形改善是整形外科最常用的治療方法之一，但臨床應用時往往有嚴格的長寬比例限制，超過一定長寬的比例皮瓣遠端常發生缺血壞死。近年來有學者將血管內皮生長因子(VFGF)用于提高皮瓣成活率及其血管新生的報道，但由于VFGF在體內易被蛋白酶分解、半衰期短，局部一次使用生物學效應不能充分發揮，而采用微球系統控制生長因子局部釋放是解決上述問題的一種有效方法。本實驗通過改良的乳化冷凝法交聯制備VFGF明膠緩釋微球并檢測其生物學性能，觀察其促進大鼠背部隨意皮瓣存活作用。

1材料和方法

1.1 材料與設備：VFGF：購自深圳晶美生物工程有限公司。明膠(等電點50，相對分子量99 000， Sigma)、美國Bio-RAD Model 550酶標分析儀、日本H600-1V型透射電鏡、美國FJ一2003型計數儀。自制VEGF-明膠微球。人VEGF定量ELLISA試劑盒(QuantiKineR，RDsystems)， 250 g/L戊二醛，丙酮，異丙醇，無水乙醚，液體石蠟，氨基乙酸為國產分析純， Span-80( Sigma公司)為進口分析純，水為雙蒸水， JJ21型精確電子攪拌器儀，TGL216G高速離心機，GENESIS凍干機(Virtis公司)，BX241 數碼顯微鏡(Olympus)。健康SD大鼠24只，體重0.20～0.25kg，雌雄不限，隨機分成A、B和C組，每組各8只。

1.2 VFGF明膠微球制備及性質測定

1.2.1 VFGF明膠微球制備：將含有10g/L Span-80的液體石蠟30ml置于三口瓶中預熱至55℃，快速攪拌下滴加入同樣溫度的明膠水溶液4ml，并調節攪拌速度至450r/min，繼續攪拌10min；形成油包水乳劑后迅速改冰浴，攪拌10min，使其完成固化；加入250g/L戊二醛0.1ml，攪拌下預固化2h，而后4℃固化24h，用丙酮、異丙醇、乙醚洗滌，揮去乙醚，真空干燥，得到粉末狀淡黃色微球。用雙蒸水洗凈有機溶劑并凍干。將200μl的VFGF溶液滴加在20mg的凍干明膠微球上，在4℃保持24h以使VFGF完全融入微球。C060照射滅菌封存。 將生理鹽水浸泡過的明膠微球涂片置于光鏡下，觀察其外形及分散度，同時測量膨脹系數.電鏡下測量500個微球的直徑計算其平均粒徑。以算術平均徑為微球的平均粒徑，計算公式為：平均粒徑=n1d1+n2d2+…+nndn/n1+n2+n3 +…+nn，式中n1，n2…nn為粒子數，d1，d2…dn為粒徑。

1.2.2 VFGF明膠微球體外釋放測定：根據人VEGF ELISA試劑盒說明用酶聯免疫儀于490nm測定吸光度值(A值)繪制標準曲線。取微球樣品10mg，放入PBS(pH7.4)緩沖液中，完全溶解后定容至100ml，取10μl另加90μl共100μl測出A值。由此計算出微球的載藥率和包封率.載藥率=(投藥量-上清液中藥量)/微球重量×100%；包封率=(投藥量-上清液中藥量)/投藥量×100%。

動態透析法進行體外釋藥實驗，將制備的復合緩釋微球10mg混懸于PBS(pH7.4)100ml中，置于37℃水浴搖床(135r/min)分別于各時間點(1，2，3，4，5，6，7天)取上清液100μl，測量其濃度，繪制復合微球釋藥曲線。

1.3 大鼠背部缺血皮瓣模型的制備：戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉，將動物俯臥位固定，鼠背部以10%硫化鈉脫毛，溫水洗凈。于鼠背正中掀起8.0cm×2.0cm隨意皮瓣，其縱軸與大鼠脊柱平行，且以之為對稱軸，蒂位于雙側髂嵴連線上。在距離蒂部3.6cm、4.8cm、6.0cm處分別作為蒂部平行的直線，與順皮瓣長軸的三等分線相交于六點，這六點為注射位點。切開皮膚及皮下，于筋膜淺層掀起皮瓣，結扎基底部活躍出血點。皮瓣掀起后即刻以微量注射器于皮下進針，A組皮瓣下每一注射位點給予200ng/ml VEGF-緩釋微球1m1，B組皮瓣下每一注射位點給予200ng/ml VEGF溶液1m1，C組皮瓣下予等量的生理鹽水注射1ml。3-0絲線將皮瓣原位縫合，切口涂紅霉素軟膏。單籠喂養。所有傷口隔日換藥。肌注青霉素10萬單位，2次/天。

1.4 觀察指標：在術后14天內對皮瓣進行觀察，觀察指標有：

1.4.1 皮瓣存活率的檢測：在皮瓣術后7天，皮瓣存活區與壞死區已明確。皮瓣壞死標準：皮瓣顏色發黑，組織回縮、彈性差，質地堅硬，切割組織不出血。用數碼相機進行皮瓣攝影，以Image-Pro Plus.v5.0軟件分析皮瓣壞死區域，利用公式(皮瓣存活率=皮瓣存活表面積/皮瓣總表面積×100)，計算各組皮瓣存活率。

1.4.2 組織學檢測：于皮瓣術后7天取皮瓣標本，OCT包埋劑包埋，液氮中保存，冰凍切片切成5μm厚度，進行行HE染色。切片在200倍光鏡下隨機選取8個高倍視野計數血管斷面數目，血管斷面密度。

1.5 統計學處理：數據均采用x±s表示，用SPSS 1 1.0統計軟件包對數據進行方差分析，而兩兩間的比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 VEGF-明膠微球的表觀，膨脹系數及平均粒徑：光鏡下及掃描電鏡觀察見制備的復合VEGF緩釋微球干粉球體分散度良好，呈圓球體， 徑粒較均勻。微球在生理鹽水中的膨脹系數為1.3(直徑)，呈球型，無粘連，無塌陷或萎縮現象。干燥狀態的微球表面有少量顆粒狀吸附物，但未見微孔和裂紋， 如圖1。在掃描電鏡下測得微球粒徑呈正態分布，大部分為10～28μm，占86.7% ，平均粒徑為(11.32±3.64)μm。凍干粉劑為淡黃色疏松粉末。加雙蒸水后為淡黃色乳狀溶液。再分散性良好。如圖2。

2.2 緩釋微球體外釋放度：根據測定的A值，計算出微球的平均載藥率為0.26%，包封率為90.6%，載藥微球的釋藥速度主要取決于藥物的擴散速度和載體材料的降解速度，明膠微球在pH＞7.0時完全降解約需2月。復合微球具有良好的緩釋性能，如圖3所示，微球在釋藥初期速度較快，而后速度減緩平穩釋放， 7天后累計釋放93%。

2.3 皮瓣觀察結果

2.3.1 3組大鼠背部皮瓣存活率分別為：A組為(68.54± 2.79)％，B組為(58.65±3.26)％，C組為(45.43±2.71)％。經統計學分析，A組與C組、B組與C組之間比較，差異顯著。A組的存活皮瓣較B、C組的顏色、質地、彈性更好，與其周正常皮膚更相似，質量更好如圖（4～6）。皮瓣存活面積見表1。

2.3.2 皮瓣的組織學檢測：3組大鼠的皮瓣進行HE染色(如圖7，8，9)，皮瓣術后7天的3組皮瓣單位面積平均毛細血管計數見表2：

3討論

血管內皮細胞生長因子（VEGF）又稱血管通透因子或促血管因子，是一種糖蛋白，能特異性地作用于其位于血管內皮細胞表面的受體，具有促血管內皮細胞增殖和遷移、促血管生成、延長血管內皮細胞壽命、提高血管通透性等生物學作用。它的受體主要為VEGFR-1(Flt-1）和VEGFR-2（KDR）。其中KDR 與血管形成和造血有關，Flt-1 在內皮細胞排列形成管腔時發揮主要作用[1]。Stepnick等[2]首次將VEGF應用于兔耳皮瓣模型，觀察到皮瓣生存力提高。此后眾多學者發現采用VEGF誘導治療性血管形成，可以提高皮瓣成活率。Khan等[3]用大鼠背部隨意皮瓣模型研究了VEGF(165)促進皮瓣存活的機制，結果認為其機制可能是：①VEGF使皮瓣在術后早期血流增加；②促進了血管新生使血流增加。同時實驗認為，VEGF可以促進NO濃度的增加；VEGF促進皮瓣存活存在劑量依賴性，其作用可以被NO合酶抑制劑阻斷。

雖然VEGF的促血管生成作用得到了學者的普遍認同但由于VEGF生物穩定性差，生物膜透過性差， 局部作用半衰期短，直接應用效果不佳。采用VEGF 基因轉染，只要少量目的基因轉染成功，一次給藥就可獲得持續表達，無需重復多次給藥，作用時間長，效果確切，是目前研究的熱點。但Poliakova應用攜帶不同濃度VEGF121的腺病毒載體(Ad．VEGF121)轉染兔、大鼠的后肢的肌肉時發現，Ad．VEGF121治療劑量可導致暫時性中等的兔陰囊水腫，超過治療劑量的濃度會引起伴有皮膚潰瘍和壞死的廣泛嚴重的兔陰囊水腫。由于基因載體的選擇、轉染效率的控制、轉染成功后外源基因對宿主基因組的影響、基因表達的效率、表達產物的生物學效應、基因局部轉染對遠隔器官病理性血管增生的影響及促腫瘤生長等問題還需深入研究，因此其應用于臨床還有一段距離。而緩釋微球載體作為新型藥物緩釋控釋系統之一，具有緩釋藥物、靶向輸送、在保證藥物治療作用的前提下減少給藥劑量，降低藥物毒性等優點[4]是目前較為簡便、安全的解決辦法之一。明膠是氨基酸與肽類交聯形成的直鏈聚合物，能進行多種表面修飾及反應，制備時可根據不同要求設計。而且明膠中含有RGD生物活性短肽有利于細胞表面粘附分子識別。明膠微球為實體微粒，被包裹藥物釋放相對緩慢，足以達到緩釋的要求[5]Kawai等采用人工皮覆蓋豚鼠背部的皮膚缺損創面，并在其間涂抹載有bFGF的明膠微球，組織學檢測發現成纖維細胞增殖和新生毛細血管數均多于單純使用bFGF組，他們認為單純bFGF體內半衰期短，而明膠微球較好地保護了bFGF的活性[6]。

本實驗采用改良的乳化冷凝法制備明膠微球，其機制是等電點為5.0 的酸性明膠在水中溶解后，分子伸展為纖維狀，在冷凍脫水的條件下卷曲，并由多個分子凝聚成球狀微粒，在固化劑(戊二醛) 的作用下，明膠分子呈穩定性良好的三維網狀結構[7]。VEGF被明膠吸附并包裹于微球中，隨著明膠的降解，實現VEGF在體內的控制釋放。而且在凍干過程中，明膠還可以取代水而與多肽形成氫鍵來穩定多肽的天然構象，從而保護因子活性。將VEGF的明膠緩釋微球應用于大鼠背部皮瓣模型可以顯著促進皮瓣的存活率，明膠微球的應用促進了VEGF的促血管新生作用，使用VEGF明膠微球后皮瓣中部的血流量明顯高于單純使用VEGF和鹽水對照組，在術后7天效果最為顯著，與緩釋微球的生物學特性符合一致。組織學檢測也同樣驗證了上述論斷，使用了緩釋微球的皮瓣其血管數目顯著增加，管腔增粗，皮瓣存活質量也比對照組質地柔軟，彈性較好。而且皮瓣中部的血流量也得到了明顯提高，VEGF微球的治療效果優于單純使用VEGF。

本實驗顯示緩釋微球能顯著延長VEGF的作用效果，能顯著增加皮瓣與受區的血管新生，增加皮瓣的血流量，從而促進皮瓣的存活率及生存質量，但如何提高微球的載藥率、延長微球的緩釋作用還需進一步研究，為其早日應用于臨床奠定堅實的基礎。

[參考文獻]

[1]LinP，Sankar S，et al.Inhibition of tumor growth by targeting tumer endothelium using a soluble vascular endothelial growth factor receptor.Cell Growth Differ 1998，9(1):49-58.

[2]Stepnick DW， PetersonMK， Bodgan C， et al. Effects of tumor necrosis factor alpha and vascular permeability factor on neovascularisation of the rabbit ear flap [J]. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1995；121(6):667.

[3]Khan A，Ashrafpour H，Huang N，et a1．Acute local subcutaneous VEGF165 injection for augmentation of skin flap viability：efficacy and mechanism[J]．Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2004，287(5)：R1219.

[4]Nimni ME. Polypeptide growth factors:targeted delivery systems[J].Bio Materials，1997，18:1201-1225.

[5]隋繼強，韓 巖，吳 紅，等. 人表皮生長因子與堿性成纖維細胞生長因子納米緩釋劑對成纖維細胞的影響[J]. 中國美容醫學，2006，15(12):1342-1345.

[6]Kawai K，Suzuki S，Tabata Y，et a1．Accelerated tissue Regeneration through incorporation of basic fibroblast growth factor-impregnated gelatin microspheres into artificial dennis[J].Biomaterials，2000，21(5)：489-499．

[7]Rita C， Elisabetta E， Maria O. Dextran cross-linked gelatin micro2 spheres as a drug delivery system[J]. European J Pharm and Biopharm，1999，47 :153.

[收稿日期]2007-12-17[修回日期]2008-03-11

編輯/張惠娟