微粒軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合纖維蛋白凝膠構(gòu)建軟骨組織工程支架材料的研究

[摘要]目的：應(yīng)用異體微粒軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)與纖維蛋白凝膠結(jié)合作為可注射性支架材料，進(jìn)行體內(nèi)構(gòu)建良好可塑性和生物特性的組織工程化軟骨。方法：制備普通家豬耳廓軟骨微粒脫細(xì)胞基質(zhì)，與體外擴(kuò)增的小型實(shí)驗(yàn)豬第二代軟骨細(xì)胞結(jié)合，以纖維蛋白凝膠為支架材料，利用其可注射性回植于實(shí)驗(yàn)豬自體腹壁外側(cè)皮下，8周后取財(cái)進(jìn)行大體及組織學(xué)檢測，并與不含微粒脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)實(shí)驗(yàn)組相比較。結(jié)果：培養(yǎng)出的組織工程化軟骨組織細(xì)胞生長良好，具有分泌軟骨基質(zhì)功能，含微粒脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出更佳的生物學(xué)性能。結(jié)論：將異體微粒軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)與纖維蛋白凝膠結(jié)合，可以作為良好的可注射性復(fù)合支架材料應(yīng)用于組織工程化軟骨的構(gòu)建。

[關(guān)鍵詞]微粒軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)（CMACTM）；脫細(xì)胞軟骨；纖維蛋白凝膠；可注射性軟骨組織工程

[中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）05-04

The application of allogenic cartilage microparticle acellular tissue matrix with fibrin glue for injectable tissue-engineered cartilage

PAN Bai-lin1，LI Jian-ning1，WANG Ping2，HAN Xue-feng3，LI Ming-sen4

(1.Department of Plastic Surgery，the Third Hospital of Beijing University，Beijing 100083，China；2. Department of Histology and Embryology， Capital Medical University，BeiJing，100069，China；3.Beijing Chaoyang Hospital of Capital Medical University，BeiJing，100020，China；4.Second People's Hospital of Taiyuan，Taiyuan 030002，Shanxi，China)

Abstract:ObjectiveTo establish injectable tissue-engineered cartilage with a new biomaterial which containing allogenic cartilage microparticle accelular tissue matrix(CMACTM) and fibrin glue.MethodsCMACTM from porcine auricle was established and combined with chondrocytes which were taken from the experimental swines and exoteric amplificated.With fibrin glue，the compound was injected back to the abdomen subcutaneously.Specimens were harvested 8 weeks later and analyzed by physics and histology，and also compared with the groups without CMACTM.ResultsChondrocytes in the cultured tissues behaved good functions of growth and secretion， and with better physical charactersin CMACTM groups.ConclusionIt is a promising way of conbining CMACTM and fibrin glue as biomaterial for injectable cartilage tissue engineering.

Key words: cartilage microparticle accelular tissue matrix(CMACTM);accelular tissue matrix；fibrin glue；injectable cartilage tissue engineering

軟骨缺損是臨床常見疾病之一。目前，治療上除了應(yīng)用自體組織和人工材料修復(fù)以外，軟骨組織工程逐步成為另一全新途徑。軟骨組織工程首要面對的兩個(gè)問題，一是如何獲得大量的種子細(xì)胞，二是如何選擇適當(dāng)?shù)闹Ъ懿牧稀６Ъ懿牧袭?dāng)中，可注射性支架材料因其創(chuàng)傷小、可塑性強(qiáng)而逐漸顯示出其獨(dú)特的優(yōu)越性。然而，通常使用的凝膠類支架材料，促分泌軟骨基質(zhì)成分畢竟有限，而且與固態(tài)支架相比，缺乏良好的細(xì)胞貼附條件[1]。本實(shí)驗(yàn)正是著眼于這一焦點(diǎn)，選取纖維蛋白凝膠（Fg）和微粒軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)（CMACTM）復(fù)合物作為可注射性支架材料，將 CMACTM三維支架的充分貼附性以及纖維蛋白膠的良好可塑性兩大優(yōu)勢相結(jié)合，再與自體軟骨細(xì)胞混合后回注動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行在體培養(yǎng)，為構(gòu)建可注射性組織工程化人工軟骨提供一條新的思路。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1 動(dòng)物：3月齡實(shí)驗(yàn)豬4只(北京大學(xué)第三醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供)；附近屠宰場獲取新鮮豬耳軟骨。

1.1.2 試劑：氯化鉀分析純(北京化工廠)，胰蛋白酶（北京均堯偉業(yè)生物技術(shù)公司），二乙胺四乙酸（EDTA，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司），磷酸緩沖鹽溶液（PBS），Ⅱ型膠原酶（美國Gibco公司），DMEM/F-12聯(lián)合培養(yǎng)基（北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司），胎牛血清（北京均堯偉業(yè)生物技術(shù)公司），纖維蛋白膠（哈爾濱瀚邦醫(yī)療科技有限公司），H-E染色試劑（北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司），Mallory染色劑（Sigma公司），甲苯胺藍(lán)染色劑（北京索萊寶科技有限公司），Ⅱ型膠原鼠抗豬單克隆抗體（美國Rockland抗體公司），免疫熒光標(biāo)記試劑（美國Rockland抗體公司）。

1.1.3 儀器：組織粉碎機(jī)（珠海北美電器有限公司），冷凍干燥機(jī)（日本Yamato科學(xué)株式會社），超凈臺，倒置顯微鏡（Olympus），熒光顯微鏡（Olympus），37℃ CO2孵箱（美國Forma Scientific 有限公司），恒溫水浴箱（北京長安科學(xué)儀器廠），電動(dòng)振蕩器（北京天成利通實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司）等。

1.2方法

1.2.1 CMACTM的制備（參考韓雪峰等[2]的制備方法）：豬耳軟骨50g用高速組織粉碎機(jī)粉碎，冷凍干燥機(jī)凍干、磨碎。150目(篩孔直徑0.100mm±0.006mm) 及100目(篩孔直徑0.154mm±0.010mm)不銹鋼濾網(wǎng)依次過篩。獲取直徑0.100 ～0.154mm 的微粒軟骨。將之置入50 ml離心管中，先后浸入1.5 mol/L KCl作用48h，去離子三蒸水作用48h，以及含有0.25%胰蛋白酶( 1∶250)+ 0.02% EDTA 中37℃水浴振蕩20h。標(biāo)本干燥后環(huán)氧乙烷消毒，置入干燥罐中備用。微粒軟骨體積與作用溶液體積比均為1∶7。所有步驟均在無菌條件下進(jìn)行。

1.2.2 軟骨細(xì)胞的獲取和體外擴(kuò)增:3月齡實(shí)驗(yàn)豬，全麻狀態(tài)下無菌手術(shù)切取豬耳軟骨塊約20mm×20mm×1mm，PBS液沖洗后用眼科剪將其剪碎成約0.5mm×0.5mm×0.5mm大小的微粒，放入約5倍體積0.3%Ⅱ型膠原酶溶液，37℃水浴振蕩消化12～16h，離心中止消化，150目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，濾液1000r/min離心10min，沉淀細(xì)胞PBS洗滌后用含20％胎牛血清的DMEM/F-12聯(lián)合培養(yǎng)基（含維生素C 50μg/ml，雙抗100U/ml）制備成細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度約為2×105/ml，接種入75cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，3～4天換液一次，約10天后第一次傳代，比例1∶4，傳代后生長迅速，約3～4天后第二次傳代，比例同樣1∶4，再次3～4天后細(xì)胞長滿瓶底，收集后細(xì)胞總數(shù)達(dá)1.0×108個(gè)，用于回植。

1.2.3 C＋CMACTM＋Fg，C＋Fg，CMACTM＋Fg復(fù)合物的制備:將制備的CMACTM 100mg（干重）放入培養(yǎng)皿中，用含20％胎牛血清的DMEM-F-12培養(yǎng)液5ml于37℃、5％CO2孵箱中浸泡24h，1000r/min離心5min，棄上清，無菌濾紙吸干沉淀物（沉淀1），備用。如前方法獲取體外培養(yǎng)1.0×108個(gè)軟骨細(xì)胞，1000r/min離心10min，沉淀細(xì)胞備用（沉淀2）。取出凝血酶和纖維蛋白原，快速37℃復(fù)溫。將0.5ml的凝血酶注入含有沉淀2的1.5ml離心管中，電動(dòng)振蕩器充分混勻，制成細(xì)胞混懸液0.5ml，形成溶液A。單用0.5ml的凝血酶，形成溶液B。將0.5ml纖維蛋白原與沉淀1充分混勻，制成CMACTM混懸液，形成溶液C。單用0.5ml纖維蛋白原，形成溶液D。將溶液A與C共同注入一個(gè)1.5ml離心管內(nèi)，充分混和、振蕩，制成C＋CMACTM＋Fg復(fù)合物；同理將溶液A與溶液D混合，制成C＋Fg復(fù)合物；溶液B與溶液C混合，制成CMACTM＋Fg復(fù)合物。

1.2.4 復(fù)合物回注入動(dòng)物體內(nèi):如上方法制備出C＋CMACTM＋Fg，C＋Fg，CMACTM＋Fg復(fù)合物的懸液各1ml，分別用3個(gè)1ml注射器配以粗針頭抽取懸液，在懸液凝固前注射入豬腹外側(cè)壁真皮下，每種懸液分2點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.5ml，從而形成C＋CMACTM＋Fg實(shí)驗(yàn)組（組1）、C＋Fg實(shí)驗(yàn)組（組2）和CMACTM＋Fg單純材料對照組（組3）。

1.2.5 取材與觀察：注射后8周取材，行大體觀察、H-E染色、Mallory染色、甲苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型膠原免疫熒光照相。

2結(jié)果

2.1 CMACTM的觀察結(jié)果：①大體觀察：軟骨微粒脫細(xì)胞基質(zhì)呈粉末狀，乳白色（圖1）；②物理性狀：干重密度 0.5827±0.1029g/ml，濕重密度 0.9835±0.0893 g/ml，含水量[（濕重重量－干重重量）／濕重重量]為40.8%；③光鏡觀察：H-E染色顯示微粒周邊粗糙不平，膠原纖維交錯(cuò)排列，未見軟骨細(xì)胞及軟骨巢（圖2）；Mallory膠原染色顯示大量縱橫交錯(cuò)的藍(lán)染膠原纖維存在（圖3）。

2.2 軟骨細(xì)胞體外擴(kuò)增：第二代軟骨細(xì)胞數(shù)量級1.0×108 個(gè)，光鏡下觀察細(xì)胞未貼壁時(shí)成圓形，折光性強(qiáng)，貼壁后初為多角形，后呈長梭形，折光性強(qiáng)，富立體感（圖4）。

2.3 組織工程化軟骨指標(biāo)檢測：CMACTM、軟骨細(xì)胞和纖維蛋白凝膠混合后復(fù)合物呈乳白色粘稠膠狀，易凝固（圖5），在復(fù)合物凝固前注入豬腹外側(cè)壁真皮下，8周后取材。以每從一側(cè)耳朵取材并擴(kuò)增后回植作為一次實(shí)驗(yàn)單元，故先后共進(jìn)行8次實(shí)驗(yàn)，其中一次實(shí)驗(yàn)單元因回植操作失當(dāng)導(dǎo)致新生肋軟骨組織未能找到，其余7次均在8周后取材。

2.3.1 大體觀察：4 周后，實(shí)驗(yàn)組1與實(shí)驗(yàn)組2均在豬腹壁真皮下接種處捫及明顯結(jié)節(jié)。注射后8周取材，剝離周圍軟組織，可見形成的不規(guī)則塊狀乳白色的類軟骨組織。實(shí)驗(yàn)組1標(biāo)本質(zhì)地稍韌，略顯黃色，有較完整包膜，剖開標(biāo)本有一定的彈性和硬度；實(shí)驗(yàn)組2標(biāo)本相對較脆，觸之松散易碎（圖6）；對照組未見明顯成形組織塊。

2.3.2 H-E染色： 8周后C+CMACTM+Fg復(fù)合物可見膜樣結(jié)構(gòu)包裹，軟骨細(xì)胞生長旺盛，均勻分布，但較正常軟骨組織雜亂，可見軟骨陷窩，并有血管形成，纖維蛋白凝膠已降解。C+Fg復(fù)合物與之比較，軟骨細(xì)胞生長密度略低，中心部位分布較稀疏（圖7～9）。

2.3.3 Mallory膠原染色：C+CMACTM+Fg復(fù)合物可見普遍藍(lán)染，證實(shí)膠原成分的存在；與C+Fg復(fù)合物相比較，存在廣泛著色較深區(qū)域，呈條索樣，分布較雜亂，考慮為CMACTM中的膠原成分（圖10～12）。

2.3.4 甲苯胺藍(lán)染色：C+CMACTM+Fg復(fù)合物均勻染成藍(lán)色，其中CMACTM成分呈現(xiàn)深紫色塊狀和條索狀，提示其中的氨基葡聚糖成分；C+Fg復(fù)合物均勻染成藍(lán)色（圖13～15）。

2.3.5 Ⅱ型膠原免疫熒光：C+CMACTM+Fg以及C+Fg復(fù)合物Ⅱ型膠原免疫熒光均表達(dá)陽性，證實(shí)組織中軟骨細(xì)胞具有分泌Ⅱ型膠原的功能。

2討論

軟骨組織工程是當(dāng)前組織工程研究的熱點(diǎn)，其組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞成分相對簡單，成為組織工程研究的理想對象。軟骨組織工程的基本要素由種子細(xì)胞、支架材料以及培養(yǎng)系統(tǒng)三部分組成。

其中，支架材料一般分為天然材料和人工合成材料，根據(jù)其空間結(jié)構(gòu)及性狀又可分為可注射性材料和三維支架材料兩種。可注射性材料與后者相比較， 其優(yōu)勢在于材料與修復(fù)組織之間嵌合好， 塑形容易， 細(xì)胞和(或)生長因子能與材料充分均勻混合，且能通過微創(chuàng)方式操作， 治療簡單、安全、有效。另外， 可注射性材料還適合于對細(xì)胞施加壓力，使之產(chǎn)生應(yīng)力刺激[3-5]。目前較為廣泛應(yīng)用的可注射性材料主要有藻酸鹽、Pluronic、纖維蛋白凝膠、膠原等，各自有其優(yōu)越點(diǎn)和局限性。隨著各種新型材料的提取及研發(fā)成功，今后可注射性軟骨組織工程逐漸向兩種或兩種以上的復(fù)合材料方向發(fā)展[6-7]。

纖維蛋白凝膠是其中應(yīng)用較多的天然可注射材料，它由纖維蛋白單體與凝血酶聚合而成。它可通過釋放?轉(zhuǎn)化因子和血小板衍生生長因子等來促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖并分泌基質(zhì)，具有良好的生物相容性，可塑性強(qiáng)，韌性極好。但是它畢竟只是細(xì)胞外基質(zhì)的成分，促分泌軟骨基質(zhì)成分能力有限，因此生成的軟骨組織與天然軟骨仍有一定的差距[8]。

脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)（ACTM）是天然支架材料中的一種，它經(jīng)多步驟的脫細(xì)胞處理，將組織中的可溶性蛋白及細(xì)胞成分被除去，保留膠原、彈性蛋白、氨基葡聚糖結(jié)構(gòu)蛋白等主要成分，為細(xì)胞生長及植入體內(nèi)修復(fù)缺損提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，已應(yīng)用于血管、豬心瓣膜軟骨等實(shí)驗(yàn)研究中[9-11]。但是，由于脫細(xì)胞基質(zhì)比較致密，孔隙率較低，因此細(xì)胞只能長到ACTM的表面，并不能深入到基質(zhì)中間。為改進(jìn)這一缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)將ACTM粉碎制備成0.100～0.154mm 的微粒，軟骨細(xì)胞與之結(jié)合后，可以圍繞于微粒周邊并且緊密相連，解決了細(xì)胞只能在脫細(xì)胞基質(zhì)表面生長的局限性。

本實(shí)驗(yàn)將CMATCTM與纖維蛋白凝膠混合作為可注射性支架材料，基于CMACTM微粒直徑較小（0.100～0.154mm），可以通過注射器具；同時(shí)選取纖維蛋白凝膠作為溶劑，為細(xì)胞與CMACTM貼附提供環(huán)境支持，將CMACTM三維支架的充分貼附性以及纖維蛋白膠的良好可塑性兩大優(yōu)勢相結(jié)合，相互彌補(bǔ)了纖維蛋白膠作為單一細(xì)胞外基質(zhì)的不足以及微粒軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)不能成塊的局限，大大提高了組織工程化軟骨的生物性能。

本實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)系統(tǒng)采取動(dòng)物體內(nèi)培養(yǎng)方式，工程化軟骨組織可通過動(dòng)物皮下的組織間液獲得營養(yǎng)物質(zhì)的交換，使中心部位的細(xì)胞得到足夠的營養(yǎng)支持，減少因中央部位組織量較少而形成的“空巢”現(xiàn)象；同時(shí)，通過動(dòng)物的日常活動(dòng)，使細(xì)胞處于機(jī)體提供的動(dòng)力微環(huán)境中生長，從而提高工程化組織的生物學(xué)及力學(xué)性能[12]。從本實(shí)驗(yàn)中獲得組織工程化軟骨組織的各項(xiàng)指標(biāo)檢測結(jié)果上看，中心部位細(xì)胞生長良好，未見明顯的“空巢”現(xiàn)象，基質(zhì)中氨基葡聚糖和Ⅱ型膠原成分亦較充足，表明新生類軟骨組織已具備一定的成熟程度，且相比之下，含CMACTM組表現(xiàn)出更為接近正常組織的特性。然而，該條件下培養(yǎng)出的類軟骨組織與正常組織仍存在著差異，從大體形態(tài)以及物理性狀上看，即使是CMACTM組，類軟骨組織結(jié)構(gòu)仍較松散脆弱，抗拉伸和抗壓縮能力尚欠佳；從組織學(xué)上反映，細(xì)胞分布較雜亂，膠原排列欠規(guī)則，決定了其生物力學(xué)性能還難以達(dá)到支持和保護(hù)的作用。可見雖然是動(dòng)物在體培養(yǎng)，但皮下的環(huán)境還不足以培養(yǎng)出足夠強(qiáng)度的工程化軟骨組織，下一步擬將復(fù)合物回植于動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨受力面，通過關(guān)節(jié)頻繁的壓縮與牽拉以及關(guān)節(jié)滑液的流動(dòng)，對組織產(chǎn)生充足的剪應(yīng)力和直接作用力，從而獲得組織量更大，生物性能更強(qiáng)的組織工程化軟骨。

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[收稿日期]2008-02-19[修回日期]2008-05-04

編輯/張惠娟