機械應力刺激對培養的人成纖維細胞分泌生長因子的影響

[摘要]目的：研究單次持續40％幅度的牽拉作用于人皮膚成纖維細胞后bFGF、TGFβ1的表達，初步探討機械應力作用下細胞增殖的機理。方法：體外培養人正常皮膚成纖維細胞，將細胞轉移至牽拉細胞培養模型中的彈性膜上，待細胞貼壁生長至75％～80％融合時，實施40％單次持續牽拉，用WESTERN-BLOT對非牽拉組與牽拉組24h、36h、48h、72h的細胞bFGF、TGFβ1進行檢測。結果：牽拉各組及對照組均呈陽性表達，但牽拉48h后兩者的表達較未牽拉時明顯增加。結論：單次40％持續的牽拉方式可以促進bFGF、TGFβ1表達，可能是導致細胞的增殖。

[關鍵詞］成纖維細胞；機械牽拉；堿性成纖維細胞生長因子；轉化生長因子β1

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）05-03

The effect of mechanical stress on the expression of growth factor in human skin fibroblast

SHU Mao-guo，YI Cheng-gang，HAN Yan，YANG Li，ZHANG Lin-xi，XIA Wen-sen，LIU Dan，GUO Shu-zhong

(Institute of Plastic Surgery， Xijing Hospital， Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi， China)

Abstract:ObjectiveTo study the expression of bFGF，TGFβ1 of human skin fibroblasts treated by mechanical stress.MethodsA new cell culture model was designed， which can load mechanical strain. Primary cultured skin fibroblasts were obtained from full thickness skin residual in skin-graft surgery. The fibroblasts were planted on elastic membranes of the model. After the 75%～80% confluence of the cell was reached， mechanical stretch was applied. The extend degree was 40% in the experiment and after stretching for 24h，36h，48h，72h， and cells were counted to quantify the protein and the expression of the bFGF， the TGFβ1 was detected with western-blot.ResultsThe expression of bFGF and TGFβ1 was positive in all groups，but the expression of growth factors was much more enhanced after stretching for 48h.ConclusionMechanical stretch with 40% extend degree and one time but continues load can increase the expression of bFGF and TGFβ1.The peak time is 48h after stretching.

Key words: mechanical stress; skin fibroblasts; bFGF；TGFβ1

機械應力刺激培養中的細胞分泌生長因子的相關文獻報道較多，但多限于其他類型的細胞，且均以測定mRNA的研究為主，作用方式亦多為周期負壓方式。單次足夠幅度的刺激是否亦能促進生長因子的分泌，分泌時間上有什么特點，既往的文獻則鮮見報道。本實驗直接檢測40%牽拉延長度的應力作用下bFGF、TGFβ1在牽拉后不同時間點的表達情況，以了解單次較大幅度的應力刺激對培養的皮膚成纖維細胞分泌bFGF、TGFβ1的影響。

1材料和方法

1.1儀器與試劑：凈化工作臺，倒置相差顯微鏡，CO2孵箱，細胞牽拉培養模型（自制），DMEM培養基（Gibco），胰蛋白酶（Gibco），胎牛血清（杭州四季青公司），Tween-20（Sigma），垂直平板電泳儀（美國Bio-Rad公司），硝酸纖維素膜（NC膜）（Clontech），鼠抗人bFGF一抗（武漢博士德），鼠抗人TGFβ1一抗（武漢博士德），羊抗鼠二抗（Sigma），ECL發光系統（Amersham公司）

1.2.1 機械牽拉細胞培養模型的制備（見圖1、2）：牽拉細胞培養模型采用直接機械牽拉作用的原理，將細胞直接種植在硅膠彈性膜上，待細胞帖壁生長后，牽拉彈性膜，而此時貼壁的細胞亦隨著彈性膜的單向拉長而拉長，同時改變細胞與細胞之間的距離。自制的牽拉細胞培養模型采用有機玻璃以及經特殊加工的硅膠膜為主要材料[1]，C060照射（11kGy）備用，牽拉延長度設置為40％。

1.2.2 細胞培養及牽拉的實施：實驗所用皮膚成纖維細胞來源于健康人體皮膚，常規行原代培養，傳代，實驗用3～5代的細胞。0.25%胰酶消化玻璃培養瓶中的正常皮膚成纖維細胞，含10%胎牛血清的DMEM培養液終止消化，反復吹打制成細胞懸液，以0.5×104～1×104個/㎝2傳至細胞培養盒中，24h后第一次換液，以后每隔48h換液，待細胞長至75%～80%滿時，更換培養液，旋動培養盒外的螺母，拉動盒內的螺桿，牽引固定板上的彈性膜，根據培養盒壁上的刻度一次將彈性膜拉長40% ，繼續置二氧化碳孵箱中培養。實驗分為對照組（未牽拉組）與牽拉24h、36h、48h、72h共5組。

1.2.3 bFGF及TGFβ1的檢測：收集牽拉與非牽拉組細胞各1×106個，蛋白裂解液裂解提取蛋白，行蛋白電泳，用WESTERN-BLOT法測定蛋白含量，將蛋白條帶轉移至硝酸纖維素膜（NC）上，加一抗（稀釋倍數為1：200），將膜裝入塑料袋中，加入PBST稀釋好的二抗液，用濾紙將膜上液體吸干，在ECL反應物中反應，壓X-線片，定影、顯影。

1.2.4 蛋白條帶采用Smartview 2001的采集、分析。

2結果

2.1牽拉不同時間點bFGF的表達：結果顯示對照組與實驗組牽拉各時間點（24h、36h、48h、72h）在分子量為18KD處均可見有陽性表達，通過對各蛋白條帶行圖像分析可看出，隨著牽拉時間點的后移，蛋白條帶的密度呈逐漸升高的趨勢，到牽拉48h時密度值達到最高，之后下降（圖3）。

2.2 生物電泳圖像分析系統采集密度值（表1）：

2.3 牽拉不同時間點TGFβ1的表達：結果顯示對照組與實驗組牽拉各時間點（24h、36h、48h、72h）在分子量為25KD處均可見有TGFβ1的表達，通過對各蛋白條帶行圖像分析可看出，隨著牽拉時間點的后移，蛋白條帶的密度呈逐漸升高的趨勢，當牽拉48h時密度值達到最高，之后便下降（圖4，表2）。

3討論

機械應力作用培養中的細胞通過自分泌或旁分泌的方式分泌生長因子，而生長因子再反作用以調節細胞的增殖、分化的理論已被廣大學者所肯定。由于生長因子與細胞增殖分化的關系，在機械應力作用培養的細胞并導致細胞增殖的研究領域中，生長因子與機械應力的關系一直是研究的熱點。

堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）是含有155個氨基酸的促有絲分裂的陽離子多肽，分子量為16～18.5KD，具有廣泛的生物功能，是中胚層和神經外胚層細胞的生長刺激劑，是重要的促細胞有絲分裂因子，是一種廣譜的有絲分裂原，是形態發生和分化的誘導因子，對成纖維細胞、骨細胞、軟骨細胞以及血管內皮細胞具有很強的促細胞分裂增殖的活性[2]，在體外培養中低濃度（1mg/ml）即能發揮作用。

機械應力作用培養中的細胞導致細胞分泌bFGF的相關研究報道不多，Cheng [3]利用周期性應力作用方式（14%延長度，1Hz）作用培養的人血管平滑肌細胞，同時比較了不同的作用次數對細胞bFGF的含量的影響，結果顯示：1次、9次、90次應力作用后總細胞bFGF的含量分別為(0.55±0.06)%，（2.9±0.3）%，（5.5±1.3）%，說明隨著作用次數增多，細胞bFGF的含量亦增多，但是，當次數超過90次甚至達到90000次時，bFGF的含量并不再增多；作者認為，機械應力作用培養的細胞并刺激細胞分泌bFGF不僅依賴于應力所造成的頻率，而且依賴應力所造成的牽拉幅度（延長度），同時作者采用4%的牽拉幅度（90次，1Hz）的應力刺激，只獲得（0.1±0.1）%的總bFGF量，但是當牽拉幅度達33%時，獲得（19.0±3.0）%的bFGF量，因而，機械應力可控制血管平滑肌細胞釋放細胞內bFGF，但小幅度的牽拉對細胞的影響則是微不足道的。

TGFβ是由多基因家族編碼的一類多效能因子，其活性結構是由質量分子為12500的亞單位肽鏈通過二硫鍵連接而成的同源二聚體（分子量為25KD），幾乎存在于所有的細胞中。TGFβ是一種具有多種生物學效應的生長因子，可以調節細胞增殖、刺激細胞外基質的合成、誘導血管形成，參與胚胎發育等。對上皮細胞表現為抑制作用而對皮膚成纖維細胞則表現為促進增殖，與組織損傷與修復密切相關[4]。

Li-Q[5]等報道利用10%的延長度、30次/min的周期性應力作用血管平滑肌細胞，24h后，膠原合成增加2倍，同時在培養基中發現TGFβ1（活性以及非活性的狀態）分泌增加，利用抗TGFβ1中和抗體能抑制牽拉導致的膠原及總蛋白合成。Takashi[6]等利用周期性應力（0.5Hz，9%～12%的延長度）對鼠腎小球系膜細胞進行作用48h后證實：TGFβ1mRNA的水平在作用后12h內一直保持不變，增加的最高峰出現在牽拉后48h，同時牽拉培養基中的TGFβ1的生物活性在12h以前較未牽拉組并未發現明顯差異。Maruyama T[7]等采用間斷的應力加載方式作用犬的腎小管上皮細胞，作用24h即可見TGF-beta1濃度增加。

本研究根據以上理論，結合臨床上擴張術、牽張術的應力作用特點，將應力作用幅度設置到40%，同時將應力作用次數改為1次（但是并不放松而繼續保持張力），研究牽拉過程中bFGF、TGFβ1的表達。結果顯示，應力作用后所有的細胞均出現蛋白的表達，但是對比發現：牽拉36h組與對照組的表達存在著明顯差異，牽拉48h組表達達到最高峰。結果證實單次足夠幅度的機械牽拉（延長度為40％）能刺激細胞分泌bFGF、TGFβ1。顯然，在擴張術、牽張術目前所采用的應力作用方式能促進人皮膚成纖維細胞增殖，同時，細胞的自分泌或旁分泌作用分泌的bFGF、TGFβ1起著相應的作用，它成功地誘導了成纖維細胞的增殖，促進了細胞外基質的分泌，這與臨床上所觀察到的結果是相一致的。

機械應力作用培養中的細胞并促使其增殖的原理非常復雜，根據Cindy[8]的總結：應力作用細胞，細胞通過其膜上的整合素、G蛋白、離子通道等感受到細胞所受的應力，通過改變其空間構向，促使離子的交換，電位的變化等，產生下一步復雜的信號轉導過程：一方面，直接牽拉與整合素相連的細胞內的細胞骨架，直接作用細胞核；另一方面則通過一系列的信號分子的聚集、活化等，產生級聯反應（機械應力作用細胞最肯定的信號途徑包括兩組：MAPK途徑，JAK/STAT，最后作用于胞核。在這一系列的反應過程中，生長因子的自分泌或旁分泌作用在細胞的增殖反應過程中起著非常重要的作用。

機械應力促使細胞增殖的原理到底是什么，是機械應力直接啟動了細胞的增殖信號？還是應力改變了細胞與細胞之間的距離，解除了接觸抑制？還是應力刺激過程中拉動了細胞與細胞之間特殊的結構連接，導致細胞上特殊的物質激活從而導致一系列信號的傳遞呢？現有的理論，多考慮為諸多因素共同作用的結果。但為什么不同的應力作用方式、不同的細胞以及不同的機械牽拉幅度會造成不同的刺激效應？機械應力對細胞的應力作用哪些是共性的，哪些是個性的？目前的研究結果遠未能解釋以上疑問。

[參考文獻]

[1]舒茂國，郭樹忠，張琳西，等. 培養細胞牽拉模型的建立與牽拉后細胞生長曲線的相關研究[J].中國美容醫學，2002，11(1)：14-16.

[2]Coltrini D， Rusnati M， Zoppetti G， et al. Biochemical bases of the interaction of human basic fibroblast growth factor with glycosaminoglycans. New insights from trypsin digestion studies[J].Eur J Biochem， 1993，214(1):51-58.

[3]Cheng GC， Briggs WH， Gerson DS， et al. Mechanical strain tightly controls fibroblast growth factor-2 release from cultured human vascular smooth muscle cells[J].Circ Res， 1997，80(1):28-36.

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[5]LinksLi Q， Muragaki Y， Hatamura I， et al.Stretch-induced collagen synthesis in cultured smooth muscle cells from rabbit aortic media and a possible involvement of angiotensin II and transforming growth factor-beta[J].J Vasc Res，1998，35(2):93-103.

[6]LinksYasuda T， Kondo S， Homma T， et al. Regulation of extracellular matrix by mechanical stress in rat glomerular mesangial cells[J].J Clin Invest，1996，98(9):1991-2000.

[7]Maruyama T， Hayashi Y， Nakane A， et al. Intermittent pressure-loading increases transforming growth factor-beta-1 secretion from renal tubular epithelial cells: in vitro vesicoureteral reflux model[J]. Urol Int， 2005;75(2):150-158.

[8]Ruwhof C， van der Laarse A.Mechanical stress-induced cardiac hypertrophy: mechanisms and signal transduction pathways[J].Cardiovasc Res， 2000，47(1):23-37.

[收稿日期]2008-03-25[修回日期]2008-05-26

編輯/張惠娟