ＨＧＦ／ｃ－ｍｅｔ蛋白在人增生性瘢痕組織中定位與表達的研究

[提要]目的：以肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）及其受體c-met蛋白為研究對象，研究其在人增生性瘢痕中的定位和表達。方法：采集住院患者的增生性瘢痕標本，以免疫組織化學染色的方法檢測HGF/c-met在增生性瘢痕組織中的定位和表達，使用計算機輔助圖像分析技術比較真皮層HGF/c-met表達水平的變化。 結果：在表皮層，增生性瘢痕組織和正常皮膚組織中的HGF/c-met均呈強陽性表達；相對于正常皮膚組織，人增生性瘢痕組織真皮層中HGF/c-met的表達明顯增加，特別是在真皮層的成纖維細胞中，差異顯著。結論：HGF/c-met在真皮層表達水平的改變可能是影響人增生性瘢痕形成的重要因素。

[關鍵詞]增生性瘢痕；肝細胞生長因子；免疫組織化學。

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2008）05-03

Experiment study of hepatocyte growth factor/c-met localization and expression in hypertrophic scar tissues

FENG Zhi，LI Shi-rong，CAO Chuan，WANG Zhen-xiang，CHEN Yan-qing，DAI Xia，XIA Shan

（Department of Plastic Surgery，Southwest Hospital，Third Millitary Medical University，Chongqing400038，China）

Abstract:ObjectiveHepatocyte growth factor（HGF） was investigated to study the localization and expression in hypertrophic scar tissues.MethodsAfter the hypertrophic scar tissues were obtained， immunohistochemistry was used to investgate the expression and location of HGF and c-met in pathologic sections. Computer-aid image analysis technology was used to detect quantitativly the change of the various protein expression.ResultsIn epidermis， HGF/c-met expression were intense staining.Compaired with normal skin tissues， HGF/c-met expression was up-regulated in hypertrophic scar tissues in dermic fibroblasts.ConlusionThe expression variance of HGF/c-met in derm could play an important role in the turnover of hypertrophic scar formation.

Key words：hypertrophic scar，hepatocyte growth factor，immunohistochemistry

增生性瘢痕( hypertrophic scar，HS) 是以成纖維細胞為主的細胞成分過度增殖和以膠原為主的細胞外基質過度沉積導致的皮膚纖維化疾病，目前其發病機制尚不清楚。肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）屬于Kringle蛋白家族，由一對69Da的α鏈和34Da的β鏈經二硫鍵形成二聚體，通過與其受體c-met蛋白相結合，表現出多種生物學活性[1]。動物實驗表明，HGF可以抑制肝臟TGF-β1的表達[2]，減弱小鼠肺纖維化模型中膠原的堆積[3]，改善傷口愈合后的形態結構[4]。

對多種纖維化類疾病的研究表明，血清中的HGF含量明顯增加[5-6]， c-met的表達還可以被HGF誘導增加[7]。但在人增生性瘢痕組織局部，HGF和c-met的表達是否改變至今仍不清楚。對此，本研究采用免疫組織化學染色的方法，結合計算機輔助圖像分析技術，試圖更詳細地了解在增生性瘢痕組織中，HGF和c-met的定位及其表達的變化，為后續的研究奠定基礎。

1材料和方法

1.1．主要材料和儀器：兔抗重組人HGF和兔抗人c-met多克隆抗體（武漢博士德公司），辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG SABC免疫試劑盒（武漢博士德公司），DAB顯色試劑盒（武漢博士德公司），防脫玻片（Promega公司，美國），PBS及蘇木精襯染液（自制），Olympus熒光顯微鏡（Olympus，日本），Image Pro Plus v6.0圖像分析軟件（ABsoft公司，美國）。

1.2．方法

1.2.1．標本的選擇：選擇5例臨床診斷為增生性瘢痕的患者，相關標準參見李世榮主編的《現代整形美容外科學》，患者無系統性疾病，病程為傷后3～6個月，常規消毒后切取增生性瘢痕中央部位，另選擇5例正常皮膚組織，來自于本科室手術患者供皮區全厚皮，標本大小均約1cm×1cm×0.5cm。

1.2.2．免疫組織化學SABC法染色：將上述標本即刻投入4%多聚甲醛中浸泡，48h后石蠟包埋并切片，貼片后微波修復，3% H2O2滅活內源性過氧化氫酶，加入羊血清封閉非特異性抗原，分別加入一抗（兔抗重組人HGF單克隆抗體和兔抗人c-met單克隆抗體，均稀釋為1∶100）4℃過夜，依試劑盒說明書要求，加入二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG單克隆抗體，均稀釋為1∶200），振洗后依次加入ABC復合劑、Tris-HCl緩沖液、底物顯色液，并以蘇木精染液行核襯染并封片；陽性對照選擇已知表達HGF和c-met的肝細胞肝癌病理切片，陰性對照選擇小牛血清。

1.2.3．計算機輔助圖像分析：機型為Lenovo Sunrise 120筆記本電腦，顯卡驅動為INTEL EXTREME GRAPHICS 6.14.10.3553版，操作系統為WindowsTMXPSP2。兩位獨立的研究人員檢測陽性表達，每張切片隨機選擇3個真皮層視野，每組共計15個放大400倍的視野，依照Image-ProPlus v6.0圖像分析軟件的使用說明，分別測量各組真皮層細胞HGF和c-met陽性表達的累計光密度（Integrated optical density，IOD）。

1.2.4．統計方法：所用實驗結果以均數±標準差（x±s）表示，采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析，檢驗水準α=0.05，P＜0.05表示有統計學差異。

2結果

2.1 c-met的表達和定位：表達c-met蛋白的細胞胞漿被染為棕黃色。在表皮層，染色陽性的表皮細胞呈多角形，并和周圍細胞相互嵌合，具有表皮細胞的形態特征。而在真皮層中，c-met染色陽性的細胞主要是成纖維細胞，呈梭形或不規則形；另外可在汗腺、毛囊上皮細胞和血管內皮細胞中看到陽性表達。正常皮膚和增生性瘢痕組織的c-met表達均主要位于表皮層，可見強陽性表達，而真皮層相對少；其中，正常皮膚組織真皮層幾乎觀察不到c-met表達陽性的細胞，而增生性瘢痕組織中，可見中等強度陽性表達的細胞。詳見圖1。

2.2 HGF的表達和定位：陽性HGF的細胞同樣被染為棕黃色。HGF陽性表達的細胞和c-met陽性表達的細胞分布情況十分相似。正常皮膚和增生性瘢痕組織的HGF表達均主要位于表皮層，可見強陽性表達，而真皮層相對少；其中，正常皮膚組織真皮層幾乎觀察不到HGF陽性的細胞，而增生性瘢痕組織中，可見中等強度陽性表達的細胞。詳見圖2。

2.3 計算機輔助圖像分析系統測量各組切片IOD的結果：使用Image-Pro Plus 6.0軟件對兩組切片真皮層HGF/c-met陽性表達的IOD進行分析，可以看到相比較于正常皮膚組，增生性瘢痕組織的HGF和c-met的表達均明顯升高（P＜0.05），其中HGF的升高幅度更加明顯，超過了7.5倍。各組的數據繪制統計表1。

3討論

目前已知，HGF可在包括肝臟在內的多種器官廣泛表達，通過與具有酪氨酸激酶活性的受體c-met蛋白結合，激活細胞內信號通路，發揮其促上皮細胞有絲分裂、運動變形、及形態塑構等多種生物學效應。皮膚組織中，HGF主要由表皮細胞和成纖維細胞合成、分泌，通過旁分泌和自分泌的方式作用于自身及臨近的細胞。HGF對c-met的表達具有正反饋作用，即HGF可以刺激其受體c-met的表達。

近年來，眾多的動物實驗表明，HGF是一種關鍵的抗纖維化疾病的內源性生長因子[3-5，8-10]。哈小琴等[11]通過使用重組的腺病毒AD-HGF處理兔耳創傷模型，發現瘢痕增生明顯減輕。Ono等[12]則發現HGF基因轉染治療創口，可以抑制成纖維細胞的凋亡、促進血管增生，進而改善瘢痕的組織形態。但是目前在增生性瘢痕病程的轉歸過程中，對組織局部微環境HGF/c-met的表達和定位仍缺乏了解。增生性瘢痕的主要特征是真皮結構的改變，其病理生理過程和成纖維細胞功能改變密切相關。本研究表明，和正常皮膚組織比較，在增生性瘢痕組織真皮層成纖維細胞HGF/c-met的表達均增強，其中，HGF的增強幅度更明顯。HGF的表達受到多種因素的影響，包括IL-1、TNF-α、PDGF、EGF和缺氧等可以上調HGF的表達，而TGF-β1則可以下調HGF的表達；而c-met蛋白則可以被HGF、EGF、IL-1和甾體類激素誘導表達[13]。

考慮到HGF的多種生物學功能，這表明HGF通過結合受體c-met，在增生性瘢痕病程的轉歸過程中發揮著重要的生物學作用。但對于這一現象仍需要深入的研究，因為和上述文獻動物實驗不同，這種高表達HGF和c-met似乎并沒有使標本供體的臨床表現消失或減輕。對此，我們推測可能有多種原因，包括增生性瘢痕發生發展的復雜機制、HGF/c-met下游產物的生物活性和增生性瘢痕組織局部微環境的改變。此外，上述文獻中動物模型的建立、HGF的作用劑量和途徑等因素也有別于本研究所采集的臨床標本，這些問題有待于更多的研究來揭示和證實。

總之，本研究的結果表明，HGF/c-met在增生性瘢痕和正常皮膚組織中均有表達，陽性細胞主要位于表皮層；而相比較與正常皮膚組織，在增生性瘢痕組織真皮層成纖維細胞表達HGF上調，并可能由此誘導其受體c-met表達升高。這種真皮層HGF/c-met表達水平的改變，提示了其在增生性瘢痕的疾病轉歸過程中可能發揮了重要作用。本研究為更好的了解HGF/c-met在增生性瘢痕中的作用打下了相應的基礎，通過更加深入的研究，相信HGF/c-met可以為防治瘢痕類疾病帶來新的研究方向和思路。

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[收稿日期]2008-02-23[修回日期]2008-05-06

編輯/張惠娟